黄斑区与周边视网膜色素上皮结构功能异同

Difference and Similarity of the Structure and Function between the Macular Region and the Peripheral Retina

摘要: 年龄相关性黄斑变性是由多种因素诱发的与年龄相关的一组黄斑疾病。其发病机制仍不十分明了。了解黄斑区与周边部视网膜区的视网膜色素上皮细胞结构和功能的异同，有助于我们了解年龄相关性黄斑变性的发病机制，引导我们找到新的治疗方法和尽早的预防疾病的发生。

Abstract: Age-related macular degeneration (AMD), a set of age-related macular disease, is induced by a variety of factors. Its pathogenesis is still not very clear. To understand the similarities and differences of retinal pigment epithelial cell structure and function of the macular and peripheral retinal regions is to contribute to our understanding of the pathogenesis of age-related macular degeneration. It will lead us to find new treatment and prevention of disease as early as possible.

1. 引言

随着科学技术的进步，人们对于年龄相关性黄斑变性疾病的发病机制及其自身和环境多种影响因素等认识越来越多，但是其发病机制仍不十分明了。年龄相关性黄斑变性其主要表现在黄斑区的视网膜色素上皮的改变，且主要表现在黄斑区。因此了解黄斑区与周边部视网膜区的视网膜色素上皮细胞结构和功能的异同，有助于我们了解年龄相关性的发病机制引导我们找到新的治疗方法和尽早的预防疾病的发生。

2. 解剖组织学

首先从解剖组织学方面，我们所认识的视网膜是眼球后部的一片薄层组织，类似于照相机里的胶卷。是由视网膜神经上皮层和色素上皮层组成。

黄斑区(macular region)为视乳头颞侧上下血管弓之间的横椭圆区域，水平直径6 mm，相当于中心视野20˚的范围。而黄斑(macular)黄斑区中央椭圆形浅碟状凹陷区，水平直径1.5~1.75 mm，相当于中心视野5˚范围。黄斑区视网膜含有叶黄素(xanthophyll)，因而呈黄色。视网膜内层向中心逐渐变薄，平均厚度0.25 mm，相当于相邻的后部视网膜的一半。黄斑的中央称中心凹(fovea)，位于视乳头偏颞侧4.0 mm，水平线下0.8 mm，黄斑浅凹陷的底部，直径0.35~0.4 mm。此范围内没有神经纤维，神经节细胞，内网状层和内核层，在其边缘，内核层减少到仅有两排细胞。在中间的0.57 mm直径内，光感受器层完全由视锥细胞组成，是视力最敏锐处。中央小凹(foveola)为中央凹的中点。黄斑周围都是毛细血管，黄斑中央的无毛细血管区直径约为0.5 mm，比中央凹的范围稍大。旁中央凹区(parafoveal area)宽约0.5 mm，内层视网膜主要为细胞成分，尤其是内核层和神经节细胞层较厚，神经纤维层也相对较厚，在其鼻侧边缘的视乳头黄斑束上尤为明显。在黄斑区视锥视杆细胞的比例是1:1。中央凹周围区(perifoveal region)宽1.5 mm，是黄斑区的周边部分。从中央小凹向外伸展2.75 mm，神经节细胞层开始变薄到仅有一排细胞核，与周边视网膜一样。此区视锥细胞与视杆细胞的比率为1:2。人类大约有500万个视锥细胞，中心凹的视锥细胞的密度达到最高20万个/mm²，是外缘密度的100倍，中心凹视敏度最高。黄斑中心凹是灵长类动物所特有的，其他哺乳类动物有一个较高细胞密度的核心区或视觉条状区域，但是无中心凹陷。这个区域视锥细胞的轴突的走向是斜对着视锥细胞足远离中心凹的，与之相连的神经元细胞集中在中心凹附近环形区域，约有6~8个细胞厚度。中心凹集中了最多的视锥细胞，细胞减小到最小，密度高达200,000/mm²，外核层略微变厚。中心凹没有血管，也没有导致视敏度下降的蓝色视锥细胞。中心凹也没有视杆细胞。视杆细胞中心凹350 um以内没有，中心凹外20度的环状区域达到最高密度。水平细胞的两种类型其细胞密度随着离中心凹的距离增加而降低。在中心10 mm范围内，每个锥细胞都连接着一个OFF型侏儒双极细胞和一个ON型侏儒双极细胞，此类结构占该区域所有视锥双极细胞的80%。侏儒双极细胞的树突野非常小，它们从单个视锥细胞接收信号然后输出给单个神经节细胞。这是灵长类动物视网膜特有结构，适合视锥密度最高处视力最敏锐。这也可能是为了红/绿颜色视觉而利用能自动颜色编码的单个视锥连接的优点。一类蓝色视锥双极细胞树突较长，只连接一种蓝色视锥细胞。视杆通路被认识是视杆细胞–视杆双极细胞–AII型无长突细胞–侏儒双极细胞–侏儒神经节细胞。AII型无长突细胞是各个通路里面的关键细胞。限定了视网膜中心的暗适应解析度。AII型网络的耦合能适应周围环境的光线变化，从而在大动态范围内优化视杆信号。在视网膜的中心区侏儒神经节细胞在数量上占优势，大约95%，视锥细胞，侏儒双极细胞，侏儒神经节细胞是一一对应。在超过2 mm或10度的区域，侏儒神经节细胞形成单独的树突群以接受从多个侏儒神经节细胞而来的输入信号。侏儒神经节细胞带有颜色编码投射在携带颜色信息的外侧其膝状体核的小细胞层。是灵长类特有的。侏儒神经节细胞是以同心的红-绿或绿-红的方式排列的，它们与视锥细胞一一对应，输出的是纯光谱。一个特定的视锥细胞的邻近细胞应是负责相反颜色的细胞。蓝色ON型视锥双极细胞向有蓝色ON/黄色OFF反应的小型双分层的神经节细胞直接输入信号。但蓝色视锥细胞驱动其他神经节细胞还不明确。而周边视网膜(peripheral retina)赤道以前的视网膜，组织学上具有典型的视网膜层状结构。

视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)始于视神经，延伸至视网膜锯齿缘，并延续为睫状体的色素上皮层。从中心凹至周边部，RPE密度降低。RPE的表型异质性：RPE细胞的形态和功能表现出区域性差异。黄斑区RPE细胞体积小，呈柱状；周边区的体积大，呈立方状[1] 。RPE的区域变化还表现在生长趋势，弹性蛋白和磷酸激酶表达水平，以及与视杆细胞外节结合和消化的动力学等方面。区域性异质性与年龄相关的改变已确认在以下方面：主要组织相容复合体II型和溶酶体酶的表达，脂质体的集聚和线粒体DNA的缺失。视网膜层状结构的排列形成视觉系统的通道，是一个复杂的过程[1] 。RPE的顶部表面与光感受器的外节相接，而基底部则与下面的Bruch膜紧密贴附，RPE细胞的基底膜构成Bruch膜的最内层结构。RPE细胞因内有色素颗粒而成棕褐色，而色素颗粒数量的变化形成眼底的典型特征。色素颗粒含量最高的是周边视网膜的RPE，最低则是位于黄斑区的RPE[2] [3] 。RPE呈立方状，表面为一层多角形细胞，其形态依所在眼底部位而发生形态变异。黄斑区细胞细高，而周边部RPE呈扁平状向外伸展，常见双核。它的典型特征包括多角形，紧密连接，顶部微绒毛，基底部质膜折叠。在结构上，细胞顶端的突起插入光感受器外节之间的间隙成为顶端微绒毛，细胞的侧面由裂隙连接，粘连小带和闭合小带形成紧密连接。细胞底部有基底膜皱褶。一个RPE细胞与30~45个视神经细胞接触。无论在结构和功能上都具有极性。功能极性化则通过膜内蛋白从细胞的顶部至基部的差异分布来表现。αvβ5整合蛋白，甘露糖受体和CD36位于RPE顶部膜区，特别是微绒毛处，对光感器外界膜盘吞噬其关键作用[4] [5] 。RPE细胞的基底膜表达α3β1，α6β1和αvβ3等整合素并介导RPE附着于Bruch膜。RPE侧面细胞膜则有特殊连接，对细胞间的互相粘附和信号交流有重要作用。和有吞噬体和吞噬溶解小体参与光感器外节物质的降解。完成物质转运，血视膜屏障，吞噬外界膜盘，并且维持与感觉部视网膜的粘连。另外RPE细胞主动合成和讲解产生细胞外基质成分，其具有极性化。RPE细胞产生一种与硫化蛋白糖和层状蛋白有关的特殊基膜，此膜含有IV型胶原纤维并构成Bruch膜的最内层[6] 。细胞外基质的成分通过激活细胞表面受体而影响细胞的行为。其降解部分由基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)之间的平衡来调节。RPE细胞合成分泌多种MMPs和TIMPs。它们的合成受周围环境中细胞因子和Bruch膜的状态所调控。在年龄相关性黄斑变性患者演的Bruch膜内也发现TIMP-3的聚集[7] 。

3. 视网膜色素上皮RPE的功能

RPE在视觉功能中至关重要，整个一生中，中央的RPE失去都是靠着周边RPE补充。它承担着营

养视网膜外层组织及维持新陈代谢的作用，可分泌细胞外基质及细胞因子，并利用细胞内的线粒体，溶酶体等细胞器吞噬，降解脱落的光感受器细胞外节，保护眼内组织。有研究表明，RPE细胞线粒体外膜的基因ARMS2与AMD的发生发展联系密切[8] -[10] 。ARMS2导致了线粒体外膜的变化，影响线粒体正常的功能，继而影响RPE结构变化，导致功能变化，出现AMD。也有研究发现A6PS突变型参与了细胞骨架的组成，致使RPE吞噬功能下降。有研究表明黄斑部细胞中ARMS2的基因和蛋白表达水平均显著高于周边部，且具有一致性，提示AMD的发生发展过程中有ARMS2参与[11] 。RPE具有合成酪氨酸酶和产生黑色素小体的能力，并负责黑色素小体的更新代谢。黑色素小体是生物合成黑色素的细胞器，人成年培养的RPE细胞可合成黑色素。在无黑色素前体时，黑色素小体的形成发生在吞噬体内和降解ROS的残余体内。黑色素颗粒位于成人RPE细胞内邻近ROS的细胞顶部。黑色素颗粒的功能是减少光的散射和阻止通过巩膜对光的吸收而使视网膜获得较好的图像。黑色素也吸收放射能并消散热能。黑色素聚散程度和氧化还原状态调节着吸收光谱和所吸收放射能的数量。另外，黑色素与氧化还原感应激活的金属离子结合，使它们失活，以保护视网膜免受这些潜在的光感应成分损伤。含黑色素多的RPE细胞产生显著少量的脂褐素[12] 。在强氧化刺激的情况下，RPE黑色素小体结构和功能的改变导致抗氧化能力的丧失。在眼睛，RPE黑色素在周边部和后极部之间的含量减少，而在黄斑区则增加。随年龄增长，RPE细胞中的黑色素含量下降，黑色素小体更加规则地分布于细胞质内[13] 。RPE有与年龄相关的特征。凋亡的RPE细胞比例随年龄显著增加，而凋亡的细胞已证明主要位于黄斑区[14] 。周边的RPE细胞可能替补黄斑区RPE的死亡。另外细胞大小和形状变得更加不规则，RPE细胞产物聚集沉积于Bruch膜，脂褐质出现于细胞质内。脂褐质颗粒的数量随年龄而增加，从化学成分讲，是来自未完全消化的视网膜的外节，任何分子降解-更新系统的损伤可加速脂褐质颗粒堆积。脂褐质含量水平与细胞分裂和代谢活性的降低相关，高含量的脂褐质可致细胞死亡。脂褐质通过减少细胞质空间和破坏细胞的结构而引起RPE细胞功能障碍。颗粒呈黄色，表现为自发荧光。脂褐质堆积与年龄相关性黄斑变性疾病有关。脂褐质聚集从出生16月开始，持续一生直到部分细胞，特别是黄斑区的细胞充满这种不能在消化的物质[15] 。脂褐质的组成成分仍不清楚，有关研究显示它含有光毒性荧光分子A2E，它可引发RPE变性[16] 。a2e，是脂褐素一个重要的组成部分，在视网膜色素上皮细胞(上皮)中，被认为调解诱导的氧化损伤与老化和其他眼部疾病。研究显示随着年龄增加A2E在RPE中明显升高，黄斑区的量只有周边区相同大小区域的1/3。视网膜类胡萝卜素与周边部RPE及脉络膜A2E呈负相关。类胡萝卜素补充剂可以完全抑制A2E形成和氧化[17] 。外层视网膜的代谢产物通过RPE细胞来交换。主要发生在有皱褶的基底膜和顶部的微绒毛。在RPE的底部表面可能存在于脉络膜毛细血管分子相应的受体参与物质转运。RPE之间的闭合小带上具有跨色素上皮的高电阻，能防止血液成分进入感觉部视网膜。吞噬外节盘膜是RPE特殊功能之一，RPE顶部位绒毛与光感受器外界交错排列，外节盘膜发生脱落时，被识别，吞噬，转运至基底部溶酶体。随年龄增加和病理改变，吞噬溶酶体降解外界物质的功能缺陷，即可沉积形成脂质颗粒。在降解过程中，发生自由基的解毒作用和过氧化物的产生。随着年龄增长眼底会出现玻璃膜疣，玻璃膜疣分为软性玻璃膜疣和硬性玻璃膜疣，混合型玻璃膜疣。有研究表明，软性玻璃膜疣主要出现在黄斑区，其形态，结构，成分，与硬性玻璃膜疣完全不同，很容易区分。其结构成分及性质且其底部有大量的BlamD沉积与年龄相关性黄斑变性的发生密切相关。硬性玻璃膜疣和混合型玻璃膜疣出现在周边视网膜区[18] 。在一项比较黄斑区和周边区视网膜色素上皮基因表的的区域差异的研究中，发现黄斑区和周边视网膜438基因不同。在这些基因中有33个基因被RT-PCR确定。有17个51%被发现典型的不同，11占33%表现一个相似的趋势。免疫染色WFDC1确定在蛋白水平的不同表达。细胞外基质基因ECM作为一个RPE数据库统计过多的基因功能确定和广泛分析。总之，33ECM基因在黄斑区和周边视网膜的表达是不同的。根据这些基因的蛋白表现在Bruch膜上。结论是区域一致的基因在人类RPE上表达不同，包括1%~5%RPE转录。这些变化也许暗示REP的生理，病理，Bruch膜的核苷酸组成和转录的变化，有区域的变化[19] 。另外的研究显示黄斑区及周边部基因相似，只有5个基因表达不同[20] 。研究显示mtDNA损伤随年龄增长而增加，损害发生黄斑区比周边严重。而且，mtDNA修复随年龄增长下降，从老年样本看，黄斑区修复能力比周边差。最有趣的是，mtDNA的损伤和AMD的程度正相关，与修复能力呈负相关。另外，在AMD眼中发现异质性突变线粒体。表明在mtDNA损伤的黄斑特异性，异质突变性，修复能力下降与年龄和AMD严重程度有关[21] 。大分子物种如视黄醇结合蛋白，铜蓝蛋白，转铁蛋白等，由脉络膜毛细血管窗孔必须弥漫在布鲁赫的膜与基底膜的视网膜色素上皮细胞(上皮)提供基本的代谢产物的神经视网膜。随着年龄增长扩散能力下降，与周边地区老化的变化相当缓慢相比，黄斑区的扩散率在第九个十年约是第一个十年的44%[22] 。通过细胞粘附因子ICAM-1在黄斑区及周边区的脉络膜毛细血管中分布的研究，显示在黄斑区和周边部分布不同，我们推测在AMD中免疫细胞介导的黄斑损伤中，黄斑脉络膜毛细血管中的ICAM-1蛋白的升高具有高度敏感性[23] 。黄斑区及周边部的RPE及脉络膜基因表达的分析等同于mRNA的表达，这些还依赖捐献者的变异，但在基因方面有个很重要的例外，黄斑区有很重要的血管成分(PEDF色素上皮衍生因子，VEGF血管内皮生长因子，VEGR-R2)，和外节(11-cisRDH)再循环。用这种AMD患者的基因分析技术能确定导致疾病的基因[24] 。在黄斑区，TSP-1表达集中在Bruch膜，在RPE基底膜，脉络膜毛细血管，脉络膜大血管壁很少。在AMD眼，除了RPE基底膜其余结构，TSP-1免疫反应明显降低，在所有眼中周边区的TSP-1免疫反应明显低于黄斑下。TSP-1免疫反应在脉络膜新生血管中低，在邻近的瘢痕组织中高。由此得出结论，降低AMD患者的脉络膜血管和Bruch膜的TSP-1也许促进CNV的形成[25] 。甲硫氨酸亚砜是甲硫氨酸亚砜还原酶中的一员，这种修复作用保护细胞受氧化损害。MSRA蛋白在整个视网膜都有，在光感受器突触，神经节细胞，米勒细胞特别多，而感光内部分的线粒体没有检测到，周边部RPE表达水平很低，而黄斑区表现强烈。提示MSRA在保护黄斑区RPE免受氧化损伤起着重要的作用[26] 。在黄斑区和周边的RPE中血红蛋白氧化酶和过氧化酶的表达降低，且黄斑区和周边区有相似的趋势，血红蛋白氧化酶有年龄相关性[27] 。

综上所述，多数的实验研究发现，黄斑区及周边区的RPE在基因，分子结构存在差异，从而导致其在抗氧化，免疫反应，组织损伤和修复方面都存在差异，也是我们研究年龄相关性黄斑变性的发病原因，机理，以及发现和改进新的治疗方法的基础。