1. 引言
甲鱼蛋(Turtle eggs)具有很高的营养价值和药用价值，既可食用又可用作种苗孵化。甲鱼蛋携带的病原菌可能来自甲鱼(Trionyx sinensis)亲体或外界环境，在适宜的温度和湿度下，病原菌大量繁殖，蛋壳上的细菌可进入蛋内导致内容物带菌，使蛋腐败变质[1] 。研究发现甲鱼蛋带菌时间可长达39天[2] ，被污染的甲鱼蛋用于幼鳖的孵化，还可能导致幼鳖患病、水体污染等一系列后果。关于甲鱼蛋携带病原菌的调查报道较少，且国内报道的主要针对进口甲鱼蛋[3] [4] ，厦门市售甲鱼蛋主要来自外地养殖企业，分散而得不到有效监管，其携带的病原菌数量及种类尚不清楚。
随着科学技术的不断进步和对细菌研究的不断深入，细菌的分类鉴定方法已从最传统的形态、生理生化鉴定发展到多位点序列测序等一系列新技术新方法，不仅提高了细菌鉴定的水平，还增强了人们对于病原微生物认识的广度和深度，然而每种方法都有本身的局限性。传统的检测方法费时费力，检测周期大约为3~5天时间，若是某些苛养菌则需要更久，受某些抗生素的影响还易发生假阴性[5] 。免疫学方法的实验结果受操作人员主观影响较大，分子生物学方法一般只能同时检测一种或几种病原菌，可以实现高通量的生物芯片成本较高，应用于实际检测还需解决许多问题。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, Time-of-Flight, mass spectrometer)是近年发展起来的一种新型的生物质谱方法，用于细菌的鉴定非常有优势，尤其是针对甲鱼蛋此类样品量大且携带菌种未知的检验项目，飞行质谱可以快速地进行高通量的鉴定工作。每种细菌都有其特异性的蛋白质，在质谱仪中就会形成区别于他种细菌的特异性质谱图，再与软件本身带有的细菌质谱图数据库进行比较，就可鉴定该株细菌的种类。MALDI-TOF-MS具有操作简便、微量化、高通量、灵敏度强和特异性高等诸多优点，现已被广泛应用于病原微生物的鉴定。
本研究应用MALDI-TOF-MS并结合血清学试验和PCR方法对厦门市售甲鱼蛋携带的病原菌进行分离鉴定，为相关部门的检疫和监管工作提供参考，促进我国甲鱼养殖业的健康可持续发展。
2. 材料与方法
2.1. 甲鱼蛋来源及所用菌株
甲鱼蛋采购自厦门市水产批发市场，共7批，编号为1(20130810)、2(20130821)、3(20130901)、4(20130930)、5(20131011)、6(20131108)和7(20131204)，每批次15个蛋，蛋均为食用冷冻品，蛋壳完整无裂痕。
霍乱弧菌05015(ctx+)和05018(ctx+)标准菌株由厦门市疾控中心提供，产肠毒素大肠杆菌(ETEC) C83902(LT+ STb+)和C83916(STa+ STb+)标准菌株，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
2.2. 培养基、诊断血清及试剂
营养琼脂、PALCAM琼脂、麦康凯琼脂、HE琼脂、亚硫酸铋琼脂(BS)、TCBS琼脂、庆大霉素培养基、血平板、营养肉汤、李氏增菌肉汤、氯化镁孔雀绿肉汤(MM)、碱性蛋白胨水(APW)和7.5%氯化钠肉汤等细菌培养基均购自北京陆桥技术有限责任公司；大肠杆菌O157诊断血清、霍乱弧菌O1和O139诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司；PCR检测试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；无水乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸(TFA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和标准肽等购自Bruker Daltonics 公司。
2.3. 方法
2.3.1. 细菌分离培养
1) 取样
无菌操作条件下，用无菌棉签蘸取灭菌生理盐水后擦拭蛋壳取样部位，完成后，再用碘酊消毒蛋壳取样部位，然后用酒精棉脱碘消毒，然后用无菌镊子将消毒部位的蛋壳破洞后，将蛋黄捣碎，再用无菌棉签蘸取内容物取样。取样完成后，蛋壳表面的棉拭子和蛋内容物所取样品分开培养。
2) 细菌分离
不同菌群分别选用相应的增菌液和选择性培养基进行分离培养。主要有单增李斯特菌用李氏增菌肉汤和PALCAM琼脂，肠道致病菌用营养肉汤、MM、麦康凯琼脂、HE琼脂和BS琼脂等，金黄色葡萄球菌用7.5%氯化钠肉汤和血平板，致病性弧菌用APW和TCBS琼脂，庆大霉素培养基专门用于霍乱弧菌的选择性分离培养。
2.3.2. MALDI-TOF-MS鉴定
1) 基质和BTS标准品的配制
用100 µl标准溶液溶解CHCA，剧烈震荡后12,000 r·min−1离心2 min，保存于4℃备用。
用50 µl标准溶液溶解BTS标准品，反复吹打使之混匀，但应避免出现气泡，静置5 mins后再吹打不少于20次，12,000 r·min−1离心2 min，取上清分装，每管5 µl，保存于−20℃备用。
标准溶液，包含50%乙腈，2.5%TFA和47.5%超纯水。
2) 纯培养物前处理及点靶
将分离到的纯菌落接种于营养肉汤，置37℃过夜培养，取1.5 ml液体培养物于Eppendorf管中，12,000 r·min−1离心2 mins，弃上清；用无菌生理盐水洗涤2次，离心弃上清；然后加入300 µl去离子水，振荡混匀，再加入900 µl无水乙醇，混匀后静置3~4 mins；12,000 r·min−1离心2 mins除去乙醇，必要时再离心一次，以确保乙醇全部除尽；最后加入50 µl 70%甲酸，振荡混匀后再加入50 µl乙腈，混匀，静置3~4 mins；12,000 r·min−1离心2 mins，取上清点靶。
先吸取1 µl上清或BTS标准品点靶，自然放干后再在上面点1 µl基质，基质干燥后上机。
3) 数据采集
将点好标准品和样品的靶板放置于仪器内，抽真空。打开FlexControl软件，校准仪器，选择数据采集方法，调好仪器参数，采用337 nm氮激光源、线性正离子检测模式，延迟时间为130 ns，误差范围为±300 ppm，离子源1加速电压20.06 kv，离子源2加速电压18.55 kv，离子源镜头电压9.03 kv，激光强度为14%~16%，每个样本选6个点进行射击，每个点射击100次。m/z的采集范围为2000~ 20,000 Da。用鼠标点击Start按钮，手动采集标准品数据进行仪器校准，再采集样品的质量图谱并保存。质量谱图也可以用AutoExecute软件自动获取。
4) 数据分析
打开BioTyper软件，将采集的图谱导入，全部选中后，选择数据库进行鉴定。
2.3.3. 血清试验和PCR
通过血清学试验和PCR对大肠埃希氏菌、霍乱弧菌进行进一步分型。
1) 血清学鉴定
分别用霍乱弧菌O1群多价血清、O139血清、O1群稻叶型血清和小川型血清对可疑霍乱弧菌菌株进行鉴定分型，用大肠杆菌O157诊断血清对分离到的大肠杆菌进行鉴定。具体操作方法为用无菌接种针挑取适量菌落在血清中涂抹均匀，同时以无菌生理盐水作为对照，排除细菌的自凝现象。
2) PCR鉴定
根据本实验室建立的方法检测霍乱弧菌霍乱毒素ctx基因，产肠毒素大肠杆菌LT、STa、STb肠毒素基因。引物大小及序列如表1。
反应体系及反应条件如下：
ctx：10 × buffer(含Mg2+)2.5 µl，2.5 mM dNTP 2.0 µl，5 U/µl Taq酶0.2 µl，10 µmol/L上下游引物2 µl，模板1 µl，补水至25 µl。
94℃ 4 min；94℃ 35 s，54℃ 40 s，72℃ 40 s共30个循环，72℃ 7 min。
LT：10 × buffer(含Mg2+)2.5 µl，2.5 mM dNTP 2.0 µl，5U/µl Taq酶0.2 µl，10 µmol/L上下游引物1 µl，模板1 µl，补水至25 µl。
94℃ 4 min；94℃ 35 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s共30个循环，72℃ 7 min。
STa：10 × buffer(含Mg2+)2.5 µl，2.5 mM dNTP 2.0 µl，5 U/µl Taq 酶0.2 µl，10 µmol/L上下游引物0.5 µl，模板1 µl，补水至25 µl。
94℃ 4 min；94℃ 35 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s共30个循环，72℃ 7 min。
STb ：10 × buffer(含Mg2+)2.5 µl，2.5 mM dNTP 2.0 µl，5 U/µl Taq 酶0.2 µl，10 µmol/L上下游引物1.5 µl，模板1 µl，补水至25 µl。
94℃ 4 min；94℃ 35 s，49℃ 40 s，72℃ 40 s共30个循环，72℃ 7 min。
3. 结果
3.1. 甲鱼蛋多重带菌情况
7批样品中，蛋壳和内容物带菌率均为100%，且所有样品都是多重带菌。带菌最多的是4号样品，
Table 1. Sequences of PCR primers, product size
表1. PCR引物序列、产物长度
多达20种，菌种类别覆盖较广。样品带菌情况如表2。
3.2. 甲鱼蛋携带细菌普查结果
经MALDI-TOF-MS结合血清学试验及PCR方法鉴定分析，该次普查的甲鱼蛋共分离到16个属26种共76株细菌，其中蛋壳分离到41株，内容物分离到35株。优势菌种为肠杆菌科细菌，有40株，占52.6%，其中肠杆菌属最多，有17株。同时还分离到了嗜水气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、奇异变形杆菌、沙门氏菌及霍乱弧菌等致病菌，血清学试验结果表明，所分离到的霍乱弧菌均为非O1非O139型。详细结果如表3所示。
3.3. 血清学试验及PCR检测结果
通过对大肠埃希氏菌、霍乱弧菌进行进一步分型得知，本次研究中分离到的大肠埃希菌均为普通大肠杆菌，无肠出血性大肠杆菌O157和产肠毒素大肠杆菌，霍乱弧菌为非O1/非O139的无毒株。血清学试验结果如表4，PCR检测结果如图1。图1中A-D分别为ctx、LT、STa、STb基因的电泳结果图。
4. 讨论
1975年，Anhalt J P, Fenselau C将MALDI-TOF-MS应用于细菌的分析和鉴定[6] ，MALDI-TOF-MS应用于病原菌的鉴定操作简便、鉴定准确度高、灵敏度高、快速、高通量等优点，由于是基于蛋白质的分析，蛋白质由基因决定，使鉴定结果更具稳定性和可信度，国内外已有许多成功的应用。鲍春梅等[7] 应用MALDI-TOF-MS建立了宋内志贺菌的数据库可并对野生菌株进行了鉴定，结果完全符合。其布勒哈斯等[8] 的研究证明，MALDI-TOF-MS不仅可以鉴定到属、种、亚种，还可进行菌株水平上的区分和鉴定。在鉴定准确度方面，与传统的鉴定方法相比，符合率在85%~95%之间[9] [10] ，与16SrRNA序列分析相
Table 2. Coexistence of multiple species in seven terrapin eggs sold in Xiamen
表2. 7批厦门市售甲鱼蛋样品多重带菌情况
Note: W-shell, N-Contents (注：W表示外壳，N表示内容物)。
Figure 1. Results of PCR
图1. PCR结果
M：100 bp DNA Marker；(A)：1-5分别为霍乱弧菌05015、霍乱弧菌05018、蛋4外菌株、蛋4内菌株、蛋5外菌株；(B)、(C)、(D)1分别为ETEC C83902、ETEC C83916、ETEC C83902；2~4分别为蛋6外菌株、蛋6内菌株、蛋7外菌株；NTC为阴性对照。
Table 3. Classification Results of MALDI-TOF-MS bacteria isolated from terrapin eggs sold in Xiamen
表3. 厦门市售甲鱼蛋所携带细菌的MALDI-TOF-MS鉴定结果
Note: The same kind of bacteria separated in the same sample using different kinds of media was calculated only once.
注：用不同种培养基在同一个样品中分离到的同种细菌仅计算一次。
Table 4. Detection results of Vibrio cholera and Escherichia coli by serological test
表4. 甲鱼蛋样品霍乱弧菌和大肠杆菌血清凝集结果
比具有更高的菌株鉴定能力[11] 。但MALDI-TOF-MS在鉴定方面也存在着一些局限性，虽然对于血液、尿液等[12] [13] 临床标本可直接进行检测，但对于像甲鱼蛋这类背景较复杂的样本还需分离纯化单菌落。由于鉴定是依赖于数据库的信息量和准确性，因此还需要不断的完善数据库，同时还要对样本处理和操作流程进行优化，以使鉴定结果准确可靠。
对厦门市水产批发市场销售的甲鱼蛋进行检验，结果检出了16个属26种共76株细菌，无论是蛋壳还是内容物都带菌，且多重带菌现象严重。本次从甲鱼蛋中分离到了4株沙门氏菌，蛋壳和内容物都有，陈建辉等[4] 也从甲鱼蛋中分离到了一株沙门氏菌，说明沙门氏菌污染甲鱼蛋的情况普遍存在。霍乱弧菌也是对人和水产品危害较大的细菌，虽然分离到的为非O1非O139群霍乱弧菌，但Sarkar A等[14] 发现某些非O1非O139群霍乱弧菌拥有2个7个碱基(TTTTGAT)的重复序列，该重复序列位于ctxAB基因上游间隔区，也有可能产生毒素。研究认为编码霍乱毒素(CT)的溶源性噬菌体CTXΦ可以整合或复制到霍乱弧菌染色体上，使无毒株变为产毒株[15] 。另外，还检出了大肠杆菌和其他条件致病，在免疫力低下时会导致疾病暴发。甲鱼蛋在存放过程中极易被环境中的细菌污染，使蛋壳携带大量细菌，这些细菌可经过气孔进入蛋内[16] ，导致内容物被污染。被污染的甲鱼蛋不仅容易腐败变质，若加工成了蛋制品还会引起食物中毒的危险，且在流通过程中会造成细菌的传播。
本研究分离的肠杆菌科细菌基本与陈建辉等[4] 2007年对台湾甲鱼蛋携带肠杆菌科情况进行的普查结果总体相一致；陈拱立等[17] 在走私的台湾甲鱼蛋中也分离到了10株非O1非O139霍乱弧菌，弗氏柠檬酸杆菌和嗜麦芽寡养单胞菌也占有很大比例，结果显示甲鱼蛋细菌类别分布广泛、构成复杂、多重带菌率高；罗朝晨等[18] 对台湾甲鱼蛋携带弧菌科细菌的普查结果显示，气单胞菌属占有较高的比例，其次为非O1非O139霍乱弧菌，也有个别蛋携带拟态弧菌和河流弧菌。本研究从厦门市售甲鱼蛋中分离到的主要病原菌基本与其他研究资料相符合，这可能与甲鱼蛋本身携带的菌种有关。另外，有个别种属的细菌存在差异，这可能与甲鱼蛋本来的生长环境、甲鱼亲体状况及运输、存放过程中的条件有关。其他菌属尚无资料进行对比。
5. 结论
目前市场上的甲鱼大部分都是由人工养殖的，由于人工养殖甲鱼的密度大，极易发生群体性细菌感染，用于孵化的甲鱼蛋的质量直接影响到甲鱼的健康。甲鱼蛋本身携带病原菌，就极可能在存放、运输及孵化的过程中使病原菌大量繁殖，使幼鳖患病，甲鱼蛋作为可食用的食品也会引起人类食物中毒。因此对于甲鱼蛋要进行严格的质量检验，以保证养鳖业健康发展和人们的身体健康。
基金项目
厦门市科技计划项目(3502z20124003)。
NOTES
*通讯作者。