摘要:
LRRFIP蛋白是能与富含亮氨酸重复序列的FLI (flightless I)蛋白相互作用的分子，参与许多生物学过程，包括作为转录抑制因子抑制TNFα以及NFκB的活性，能与其他蛋白相互作用调控Wnt/β-catenin信号通路进而参与细胞骨架的重排以及作为胞质内外源核酸感受器参与抗病毒过程等。系统进化分析显示，高等哺乳动物中的LRRFIP1和LRRFIP2，以及鱼类中LRRFIP1a，LRRFIP1b和LRRFIP2都是由早期多细胞动物中单一的原始的LRRFIP进化而来。
Abstract: LRRFIPs was originated as proteins interacting with leucine-rich repeat flightless I gene (FLI); it is involved many functions, including acting as a transcriptional repressor to inhibit TNFα and NFκB activity, interacting with other proteins to regulate Wnt/β-catenin signaling pathway for cytoskel-eton rearrangement, and function as cytosolic nucleic acid sensor against exogenous virus. Phylo-genetic analysis revealed that LRRFIP1 and LRRFIP2 in mammals, LRRFIP1a, LRRFIP1b and LRRFIP2 in fishes are all evolved from single proto LRRFIP in early multicellular organisms.
1. 引言
LRRFIP (leucine-rich repeat in flightless-interaction protein)是一种可与富含亮氨酸重复序列的FLI (flightless I)蛋白相互作用的分子，在上世纪90年代就已经在人的T淋巴瘤细胞克隆出了LRRFIP1蛋白，只不过那时称之为GCF2 (GC-binding factor2)，之所以称之为GCF2因子，主要是因为它是利用已在表皮癌细胞中被克隆出来的GCF cDNA进行核酸杂交得到的两个分子中的一个，这个GCF是能够结合在某些基因启动子富含GC的区域，GCF2功能与这个早先发现的GCF类似，都能抑制这些基因的表达，如结合在表皮生长因子受体EGFR基因启动子富含GC的区域并抑制其表达 [1] ，但这两者的蛋白序列是不同的。几乎在同一时期，人们又在人和老鼠中发现了FLAP蛋白，它含有N端卷曲螺旋域，通过GST pull down实验证明其与FLI LRR能够相互作用；在CHO-K1细胞系含有TRIP (TAR RNA interacting protein)蛋白且其N末端与FLAP蛋白的N端卷曲螺旋域高度同源 [2] [3] ，说明这两个基因很可能是同源基因(或一个物种中一个基因的不同剪切体)，现在它们都被重新命名为LRRFIP1蛋白。稍晚一些时间，人们利用酵母双杂交系统又进一步证实了人的LRRFIP1能与FLI蛋白的LRR结构域相互作用，并且发现了另一个新的与之作用的蛋白LRRFIP2，它与LRRFIP1具有一定的同源性(啮齿类LRRFIP1和LRRFIP2同源性在41%左右) [4] ，初步推测它们竞争结合同一位点，执行相似的功能。
2. LRRFIP的结构
lrrfip基因的一个显著特点就是有很多亚型或剪切变体。例如，通过在NCBI搜索人类基因组数据库，我们发现lrrfip1和lrrfip2至少分别存在49、32种变体，其他脊椎动物中也存在类似情况，这可能与基因表达的差异调控有关 [5] 。对于LRRFIP1亚型3而言，它包含了一个N端未知功能的结构域，一个由87个氨基酸组成的卷曲螺旋和一个核酸结合区域(图1) [6] ，其实在几乎所有物种的LRRFIP1同源蛋白中，均发现卷曲螺旋结构，且该结构高度保守。LRRFIP2也存在这个保守的卷曲螺旋结构，但并不存在与LRRFIP1类似的DNA结合结构域，且N端结构变化较大。
3. LRRFIP1的功能
LRRFIP1广泛表达在各组织器官，定位于细胞质或者细胞核中，与细胞系或细胞状态相关 [7] ，具有许多复杂功能。在细胞核里，主要作为转录抑制子来降低表皮生长因子受体的表达、PDGFα链的表达以及直接调控TNFα的表达，而TNFα可以激活NFκB，因此LRRFIP1可以抑制NFκB的活性 [8] ，后来有研究发现，LRRFIP1能与TNF上游启动子区域的已结合polycomb的非编码RNA直接结合，形成抑制复合物调控TNF的表达 [9] 。另外，TNF启动子区域的多态性也会影响LRRFIP1对它的调控，不仅如此，谷氨酸转运子EAAT2基因启动子区域存在一种普遍的突变形态：这种突变消除了AP-2基因调控位点，同时产生了转录抑制因子LRRFIP1的结合位点，导致大鼠缺血脑中LRRFIP1呈现高表达状态，与血浆中谷氨酸浓度升高以及人中风早期高频的神经功能恶化有关 [10] 。
Figure 1. Structure of LRRFIP1 [6] . (a) Domain structure of LRRFIP1 (b) End-on and (c) side views of the LRRFIP1-CC homodimer
图1. LRRFIP1的结构 [6] 。(a) LRRFIP1结构域 (b) 卷曲螺旋二聚体的末端视图 (c) 侧面图
胞质中，LRRFIP1能与其他蛋白如Fli-I、Dvl等相互作用 [11] ，也会通过调控RhoA的表达来影响细胞骨架结构。例如，外源LRRFIP1可以激活β-catenin依赖的转录过程，但却被Fli-I所抑制；LRRFIP1可以和p300协同作用来调控β-catenin和LEF1/TCF的转录，但Fli-I能打破它们的这种协同作用，它们的互作参与了细胞骨架的重排过程 [7] 。除此以外，LRRFIP1能与结合了GSK-3β的Dvl相互作用，通过抑制β-catenin的磷酸化，来调控Wnt非经典信号通路的平面细胞极性 [12] 以及癌细胞中的经典Wnt信号通路 [4] 。LRRFIP1还能促进细胞的转变，如沉默LRRFIP1能上调β-catenin的磷酸化水平并降低其在核内表达的水平从而抑制Wnt/β-catenin信号通路，达到反转上皮细胞间质转型(EMT)的目的 [13] 。不仅如此，LRRFIP1会正向调控RhoA的表达，而过表达LRRFIP1反而会抑制RhoA的表达，进而破坏actin或者细丝蛋白的结构 [14] 。RhoA可与LARG蛋白的RGS结构域互作，通过调节整合素依赖的RhoA激活来诱导细胞粘附、迁移与浸润等过程，促进结肠、直肠癌细胞的转移 [15] 。
在免疫方面，LRRFIP1能与Fli-I和髓系分化因子88 (Myd88)相互作用，而且能够通过与Myd88相互作用正调控TLR免疫反应以及核因子NF-κB [16] 。胞质中的LRRFIP1能结合双链RNA，是一种胞内模式识别受体，能够探测外源病毒 [17] ，此时LRRFIP1可以直接与dsRNA以及AT或GC含量丰富的dsDNA结合 [18] 。已经证明机体在受到poly(I:C)、poly(dA:dT)或poly(dG:dC) dsDNA的刺激后，过表达LRRFIP1能够显著增强IFN-β的表达量 [19] ，同时，特异性地敲降LRRFIP1的siRNA能抑制β干扰素的产生，进一步的研究表明，LRRFIP1能够与β-catenin相互作用并使得后者激活并结合到转录因子IRF3的羧基端，从而启动IFNβ的转录，说明LRRFIP1能够调节I型干扰素的表达，而该调节过程是通过识别B型、Z型DNA和dsRNA、RNA病毒实现的 [20] 。另外也发现，LRRFIP1能增加IFN-β在肝细胞中的表达，丙肝病毒的存在可以增强这种诱导作用，但是并不能诱导胞质中LRRFIP1的表达，过表达LRRFIP1可以抑制丙肝病毒的复制 [21] 。
LRRFIP1还有其他功能，如lrrfip1被miR-132敲降之后，能抑制平滑肌细胞的增殖 [22] ；磷酸化的LRRFIP1会下调其本身的抑制活性，促使巨噬细胞多核化 [23] ；LRRFIP1能调控血栓形成，通过与血小板表面相关的蛋白相互作用来改变血小板细胞骨架结构，影响血小板的凝血功能 [24] 。另外，lrrfip1基因的SNP与肥胖、炎症以及精神分裂等病症有关 [25] 。
4. LRRFIP2的功能
相比LRRFIP1，LRRFIP2的功能研究较少。研究发现，它在各组织如肺、肝、脑、肌肉等的细胞中都有广泛表达，主要参与细胞内信号通路的活化和调控，在发育和免疫中起作用 [26] 。在发育方面，LRRFIP2在其基因组第26-29外显子上发生的突变和林奇综合症有关 [27] 。LRRFIP2能够与Dvl相互作用来增加细胞内β-catenin的表达水平，并激活β-catenin/LEF(淋巴细胞增强子结合因子)/TCF(T细胞因子)依赖的转录活性，爪蟾胚胎中高表达LRRFIP2可诱导双脊形成和Wnt靶向基因的表达，说明LRRFIP2在Wnt信号转导过程中起作用 [28] 。在免疫方面，LRRFIP2和LRRFIP1可以竞争性地和MyD88相互作用来激活TLR4信号通路 [4] ，由于LRRFIP2含有很多丝氨酸残基，有研究者发现了对LPS刺激敏感的第202位磷酸化位点的变化。进一步的研究发现，这个位点的磷酸化修饰可以动态调控LRRFIP2-MyD88之间的相互作用，从而调控TLR4信号通路的强度和持续时间 [29] 。另外，也发现泛素化修饰LRRFIP2可以降低其对LPS刺激的敏感性 [30] ，而在LPS刺激巨噬细胞之后，LRRFIP2能正向调控NFκB以及促进细胞因子的产生。最近的研究表明，在巨噬细胞中，LRRFIP2是炎性复合体活化的负向调控蛋白，LRRFIP2可以通过与NLRP3相互作用促进Flightless-I蛋白发挥其抑制Caspase-1活性的功能，从而抑制炎性复合体的活化以及IL-1β的剪切成熟 [26] 。在无脊椎动物如凡纳滨对虾中也发现了LRRFIP2基因，在昆虫细胞中过表达LRRFIP2可以增强抗微生物多肽的表达，对肠炎弧菌的抵抗具有一定效果 [31] 。
5. LRRFIP的演化
蛋白同源性搜索发现，LRRFIP仅存在于后生动物中，在植物、真菌和原生生物中并没有发现它的同源基因，它是一类非常小的蛋白家族。选择几种代表性物种的同源基因的蛋白利用邻接法(NJ)构建该基因的系统进化树，结果如图2所示：在低等多细胞动物海绵中，只有单拷贝的LRRFIP，已知的文昌鱼中
Figure 2. Phylogenetic tree of LRRFIP
图2. LRRFIP系统进化树
只含有一个LRRFIP，而当进化到脊椎动物时，明显的分为两簇，一簇为LRRFIP1，另一簇为LRRFIP2，在鱼类如斑马鱼中，由于基因组的复制，LRRFIP1还分化出LRRFIP1a和LRRFIP1b，它们分别处在第9和第6号染色体上，但LRRFIP2 (在第13号染色体上)并没有发生复制现象。
6. 总结与展望
通过20多年的研究，人们对LRRFIP基因家族有了初步的认识。LRRFIP不仅能够作为转录抑制因子在发育中起作用，而且还可以作为模式识别受体识别外源核酸，在免疫反应中起作用。在医学上，LRRFIP1与癌细胞转移，血栓形成，炎症反应等都有关系，因此，需要在模式生物中利用基因组编辑技术如TALEN、Cas9或NgAgo-gDNA对LRRFIP基因家族的基因功能以及调控机制进行深入的研究。同时，由于LRRFIP基因在低等无脊椎动物中如文昌鱼中只有单拷贝，研究它的功能或许能为高等物种同源基因的功能研究提供有益启示。
基金项目
山东省自然科学基金(ZR2012CM015)。