1. 引言
植物自交不亲和性(Self-incompatibility, SI)是指能产生具有正常功能且同期成熟的雌雄配子的雌雄同体植物，在自花授粉或相同基因型异花授粉时无法受精的现象 [1] 。据报道，自然界中已在74科250属约3000种以上的显花植物中发现了自交不亲和现象 [2] [3] ，特别是十字花科、禾本科、豆科、蔷薇科、茄科、菊科、罂粟科、石蒜科等。
SI是目前所知的最主要的一种显花植物控制受精的机制，是由雌蕊细胞和花粉之间相互作用产生的生理反应。这两种独特细胞间的接触是受空间和时间的授粉行为控制的，这远不同于其他细胞间的信号转导 [4] 。因此，SI不仅为研究植物生殖细胞间信号识别和转导、细胞间相互作用和基因时空表达提供了一种理想模型，而且在作物遗传改良和杂种优势利用上具有重要价值。理论和应用上的双重价值，使得植物自交不亲和性成为近年来植物分子生物学和作物育种学研究的重要热点之一 [5] [6] 。
沙田柚为无患子目、芸香科、柑橘属植物，为严格的配子体自交不亲和植物。关于沙田柚自交不亲和机理的研究取得一定得进展，薛妙男等确定沙田柚为配子体自交不亲和类型，花粉管在花柱1/2处生长受到抑制；通过免疫胶体金技术，确定自交1-3天花柱通道细胞S-蛋白产生部位及分布位置 [7] [8] [9] [10] 。杨继华等 [11] [12] 通过双向电泳鉴定沙田柚得到花柱特异性蛋白，并对该蛋白的分子量、等电点以及N-末端氨基酸序列进行了测定。秦新民等分离和鉴定沙田柚花粉管特异性蛋白；确定了特异蛋白在花粉管中的产生部位以及分布位置 [13] [14] [15] 。
为了进一步探讨沙田柚自交不亲和的机理，我们对自交和异交花柱进行了转录组测序，通过自交与异交花柱差异基因的比对，获得了一个沙田柚谷胱甘肽转移酶基因，并对该基因编码的蛋白质进行了生物化学特征分析，旨在为沙田柚自交不亲和分子机理的深入研究提供帮助。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
沙田柚实验材料采自广西灵川县潮田乡大山口村果园十年生结果树。在盛花期对沙田柚样树进行人工自交(沙田柚 × 沙田柚)授粉和异交授粉(酸柚♂ × 沙田柚♀)，分别收集自交和异交1~3 d的授粉花柱以及当天未开花的花柱，立即放入液氮中保存，并放入−80℃超低温冰箱备用。
2.2. 方法
2.2.1. RNA的提取、建库和测序
总RNA的提取按改良Trizol法进行 [16] ，建库和测序同参考文献 [17] 。
2.2.2. 序列分析和系统树构建
使用DNAman、Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos2.0、SignaIP4.1等软件进行序列的开放阅读框(ORF)、编码氨基酸、编码蛋白的理化分析。将测定的基因序列与GenBank中的13种植物的同源序列进行比对，基于氨基酸序列谷胱甘肽S转移酶基因的系统进化树用DNAman软件进行构树。
3. 结果
3.1. 基因的生物信息学分析
谷胱甘肽S转移酶基因(Unigene16804_All)全长872 bp (GenBank登录号为KY612456)，包含一个657 bp的开放阅读框(ORF)编码219个氨基酸(图1)。
3.2. 编码蛋白质的分析及疏水性的预测
通过在线软件protparam分析(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)，该基因基因编码的蛋白质分子质量为25.00 kDa；理论等电点为5.48；共由3517个原子组成，分子式为C1149H1753N283O322S10；不稳定指数为33.42 (<40)，为稳定蛋白。
用DNAMAN预测该蛋白质的疏水性：该基因编码的蛋白质疏水性最大值为3.04，亲水性最小值为−3.11。综合表明该蛋白质疏水性平均值为−1.93，为亲水蛋白(图2)。
3.3. 跨膜预测
跨膜预测的结果显示该基因编码的蛋白质存在着2个跨膜区。跨膜方向由内向外有149~167位氨基酸；跨膜方向为由外向内的有6~22和143~165位氨基酸(图3)。
3.4. 保守结构域分析
该蛋白质有两个保守结构域，一是GST_C_superfamily (谷胱甘肽转移酶超家族)，位于该蛋白质的第85~215位，二是Thioredoxin_like superfamily (硫氧还蛋白超家族)，位于该蛋白质的第1~75位(图4)。
3.5. 磷酸化位点预测
该基因编码的蛋白质可能的磷酸化位点共有16个，其中Ser磷酸化位点11个，分别位于肽链的32、67、82、93、115、149、174、190、194、196、198位；Thr磷酸化位点1个，位于肽链第169位；Tyr磷酸化位点共有5个，分别位于肽链30、90、101、107和206位。表明该蛋白的磷酸化以Ser磷酸化为主，兼有Thr和Tyr磷酸化(图5)。
Figure 1. Nucleotide sequence and amino acid sequence of Unigene16804_All gene
图1. Unigene16804_All序列和推测氨基酸序列
Figure 2. Hydrophobicity analysing of Unigene16804_All
图2. Unigene16804_All蛋白疏水性分析
Figure 3. Result of TMpred Prediction of Unigene16804_All
图3. Unigene16804_All跨膜区预测
Figure 4. Conserved domains of porcine Unigene16804_All
图4. Unigene16804_All蛋白保守结构域
Figure 5. Phosphorylation site analysis of Unigene16804_All
图5. Unigene16804_All蛋白的磷酸化位点分析
3.6. 信号肽预测
利用SignaIP4.1软件对沙田柚谷胱甘肽转移酶基因编码的氨基酸序列进行分析，结果表明该蛋白质没有明显的信号肽。
3.7. 二级结构和三级结构预测
通过在线分析软件Predict Protein (http://www.predictprotein.org/)对谷胱甘肽转移酶蛋白二级结构进行预测，结果显示该蛋白含有螺旋、折叠和无规则卷曲，所占比例分别是54.34%、5.48%、40.18%。
利用SWISS-Model对沙田柚谷胱甘肽转移酶蛋白三级结构进行预测，结果表明：该蛋白三级结构含有14个α-螺旋，7个β-折叠，其间由无规则卷曲连接(图6)。
3.8. 同源性分析
从GenBank数据库中下载13种植物谷胱甘肽转移酶基因编码的氨基酸序列，序列进行比对结果表明沙田柚谷胱甘肽转移酶基因编码的氨基酸与芸香科的克莱门柚(Citrus clementina, XP_006432070.1)谷胱甘肽转移酶蛋白的同源性为98%。利用DNAMan构建系统发育树，结果表明沙田柚谷胱甘肽转移酶基因编码的蛋白质与芸香科的克莱门柚(Citrus clementina)有很近的亲缘关系，属于同一个进化分支(图7)。
4. 结论与讨论
氨基酸序列同源性分析表明，本文所克隆的沙田柚基因(Unigene16804_All)与克莱门柚谷胱甘肽转移酶的同源性均为98%，通过对该基因编码蛋白的功能结构域分析，发现该蛋白具有谷胱甘肽转移酶保守结构域，表明Unigene16804_All属于谷胱甘肽转移酶超家族基因。
Figure 6. The tertiary structure of Unigene16804_All
图6. Unigene16804_All蛋白的三级结构
Unigene16804_ALL (沙田柚)，Citrus clementina (克莱门柚，XP_006432070.1)，Capsicum annuum (辣椒，XP_016556906.1)，Nicotiana sylvestris (美花烟草，XP_009776045.1)，Nicotiana tabacum (烟草，XP_016433645.1)，Prunus mume (梅，XP_008240792.1)，Ziziphus jujube (枣，XP_015874673.1)，Arachis ipaensis (野生花生XP_016170182.1)，Cicer arietinum (鹰嘴豆，XP_004488707.1)，Eucalyptus grandis (巨桉，XP_010062724.1) Jatropha curcas (麻风树，XP_012087687.1)，Vitis vinifera (葡萄，XP_002264437.1)，Populus euphratica (胡杨，XP_011036235.1)，Prunus persica (桃，XP_007213037.1)
Figure 7. Phylogenetic tree based on amino acid sequences of the Glutathione S-transferase protein
图7. 基于氨基酸序列的谷胱甘肽转移酶蛋白系统发育树
植物的谷胱甘肽转移酶(GST)是一个多基因家族，植物的GST分为φ、τ、ζ、θ、λ和脱氢抗坏血酸还原酶(DHARs) 6类 [18] [19] 。GST在植物的初级代谢、二级代谢、胁迫耐受和细胞信号转导中行使功能，从而影响植物的生长发育 [20] 。此外，GST家族蛋白还参与了植物黄酮类物质的积累和运转 [21] 。例如，牵牛花中An9基因编码了一个Phi类的GST，能与花青素形成复合物并参与其转运 [22] ，而拟南芥中同属于Phi类的TF19基因则同时参与了花青素和浓缩单宁的转运 [23] 。类黄酮除了具有保护植物免受紫外线伤害、抵抗病原菌的侵害等功能外，类黄酮对植物生殖发育也具有重要的影响，如参与花粉–雌蕊的相互作用的过程 [24] 促进花粉萌发，及影响花粉管的极性生长中起作用 [25] [26] 。
本文克隆的谷胱甘肽转移酶基因在沙田柚未授粉，以及自交花柱和异交花柱中的表达存在较为明显的差异：未授粉花柱中该基因的表达量(FPKM)为0.106，自花授粉1，2，3 d花柱中的表达量(FPKM)分别为3.32、5.98、2.45，异花授粉1，2，3 d花柱中基因的表达量(FPKM)则分别为2.26、3.51和14.16。从上述结果可以看出无论自交授粉还是异交授粉，第1 d花柱中谷胱甘肽转移酶基因的表达都表现为迅速升高，在自交授粉状态下，基因的表达第2 d稍许升高，第3 d则下降。而异交授粉过程中，该基因的表达则表现为持续升高。
沙田柚谷胱甘肽转移酶基因的这种表达模式与其参与花粉-雌蕊的相互作用和影响花粉管的极性生长的功能相符。薛妙男等 [7] 观察到沙田柚自、异花授粉的第1 d，其花粉的萌发和花粉管的生长行为相同。花粉在柱头上经水合作用开始萌发，4~8 h花粉管通过柱头乳突细胞间隙进入柱头，16~24 h即可进入花柱道。随后，自交与异交授粉花粉管的生长出现明显差异，自花授粉的花粉管2~3 d时在花柱的1/2处生长受阻，而异交授粉花粉管则能正常生长，进入子房完成受精。谷胱甘肽转移酶基因在自花和异花授粉的第1 d均高表达，与其参与花粉-雌蕊的相互作用功能相关。随后该基因的表达与花粉管在花柱中的生长密切相关，异花授粉2~3 d内基因表达活性急剧上升，而同期自花授粉状态下，该基因的表达呈现下降，与之对应的是花粉管生长受阻，不能完成受精。因此可以推断谷胱甘肽转移酶可能参与了沙田柚授粉和自交不亲和性过程。但其机理有待进一步收入研究。
基金项目
国家自然科学基金(31360477)；广西教育厅项目(2013YB036)。
*通讯作者。