1. 引言
衰老是随着时间的推移，生物体出现的生理功能和形态结构退行性变化的过程，是人类生命进程中不可避免的。根据联合国世界人口及世界人口老龄化资料，全球超过60岁老龄人口的比例从1990年的9.2%升高至2013年的11.7%，并预计到2050年老龄人口将超过20亿，比例将占全球总人数的21.1% [1] 。其中，我国自从上个世纪实行计划生育以来，老年人口在总人口中占得比例相对提高，老龄化进展较其他发展中国家快，据世界卫生组织中国老龄化报告显示，预计中国超过60岁老龄人口的比例将从2010年的12.4%升高至2040年的28% [2] 。衰老过程在整体、组织、细胞乃至分子水平随处可见，导致衰老的原因又是多方面的，衰老机理也极为复杂。目前常见的衰老学说有衰老基因学说、端粒DNA缩短学说、自由基衰老学说 [3] 等。面对当下越来越严峻的社会人口老龄化趋势，如何延缓衰老、降低衰老相关疾病的发生率以及延长机体寿命受到越来越多人的重视。
拥有简单易操作的生物活性筛选模型对于从天然产物中探寻具有潜在抗衰活性的化合物具有重要意义。现阶段，用于抗衰老研究的主要生物模型有酵母、线虫、果蝇、小鼠等。其中小鼠属哺乳动物，亲缘关系与人类最近，用小鼠做实验所得的结果更具有可信度，但其繁殖饲养的费用较高，实验周期较长且不容易操作，因此更多地用于药物研究后期而很少在药物初筛阶段使用。酵母、线虫、果蝇虽属低等生物，与人类的亲缘关系较远，但是均有人类衰老调控子的同源基因，且由于其简单易操作的优势一直是抗衰老研究的主要模型。其中酵母衰老的重要调控子组蛋白去乙酰化酶Sir2和人类的SIRT1是同源蛋白，都对衰老有着重要的调控作用 [4] 。因其生命周期短，成本低，操作简单，便于大量培养而更适合实验室初步筛选抗衰老物质。
1996年Bobola等发现了酵母的突变株K6001，该突变株在葡萄糖培养基中，只有母细胞会分裂增殖，而子细胞不能持续分裂，因此单个母细胞产生子细胞的个数是能确定的 [5] ，此突变株的发现大大简化了传统测试酵母细胞复制性寿命的方法及操作。2004年，Jarolim等将这株酵母细胞应用于酵母复制性寿命的研究，并且发现其在白藜芦醇(10 µM)的条件下，其复制性寿命同样可以被显著延长 [6] 。本团队在酵母突变株K6001活性系统引导下，已从多种天然产物如天麻 [7] 、淡菜 [8] 、麦冬 [9] 、灵芝孢子粉 [10] [11] 等中提取分离出来多种结构类型不同的具有抗衰老活性的化合物。
玛咖(Lepidium meyenii Walp)原产于秘鲁海拔3500 - 4450米的安第斯山脉。玛咖在秘鲁当地作为药食两用的植物已经有2000多年的历史。传统上用于改善性功能、提高生育能力、抗疲劳、免疫调节等 [12] [13] ，而且无任何毒副作用，以玛咖为主要原料的各类保健品近年来受到越来越多人的青睐。韩国圃美多公司以秘鲁胡宁省栽培的玛咖为原料，在萃取压力为30 MPa，萃取温度为40℃的条件下进行超临界CO2萃取，之后，将糊精、阿拉伯胶与其混合最终使它成粉末状，最终得到玛咖超临界提取粉末。
本研究对韩国圃美多公司来源多个产品进行筛选，对玛咖超临界提取粉末的抗衰老活性物质进行了研究，在酵母突变株K6001活性系统引导下，分离得到两个玛咖酰胺(macamide)类化合物n-benzyl-(9Z)-octadecenamide(1)，n-benzylmyristamide(2)，且具有显著的延长酵母突变株K6001复制性寿命的作用。
2. 材料与方法
2.1. 材料与仪器
P-230型高效液相色谱仪(大连依利特公司)；6224A TOF 型液质联用(美国Agilent公司)；AVIII-500型核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；色谱柱Capcell PAK C18，色谱柱Develosil PH-HG-5(日本Nacalai tesque公司)；K6001菌株由奥地利萨尔茨堡大学的Breitenbach教授提供；玛咖超临界提取粉末由韩国圃美多公司提供；油酸(>85%，东京化成工业株式会社)；无水二氯甲烷(99.9%，北京百灵威科技有限公司)；新戊酰氯(99%，北京百灵威科技有限公司)；卞胺(99%，北京百灵威科技有限公司)；DMAP，4-二甲氨基吡啶(99%，阿拉丁)；其他试剂为色谱纯或分析纯。
2.2. 生物活性测定方法
2.2.1. 培养基的配制
1)半乳糖液体培养基的配置：1％酵母粉、2％蛋白胨、3％半乳糖(质量体积比)，121℃高压灭菌20分钟后，备用；
2)葡萄糖液体培养基的配置：1％酵母粉、2％蛋白胨、2％葡萄糖(质量体积比)，121℃高压灭菌20分钟后，备用；
3)固体培养基的配置：相应液体培养基加入2％琼脂(质量体积比)。
2.2.2. 活性测定方法
1)将冻存于−30℃冰箱中的K6001菌株取出，恢复至室温后，用PBS清洗三次，然后加入到5 mL无菌的半乳糖液体培养基中，28℃，160 rpm摇床中培养24~28 h至其生长至对数期后，从摇床中取出酵母菌株，混匀后取出1 mL，离心，用PBS洗涤三次，除去所含的半乳糖液体培养基，再用PBS稀释后，用血球计数板于显微镜下观察计数。
2)向直径6 cm的玻璃培养皿(已灭菌)中加入5 mL葡萄糖培养基(含2％琼脂)，待冷却成固体培养基后，分别向不同的培养皿加入用等体积乙醇溶解的阳性(10 µM白藜芦醇)或其他样品，待乙醇挥发后，分别加入约5000个酵母，用灭菌后的玻璃涂布器将其均匀地涂布于培养基表面，在28℃的条件下培养两天。
3)在10倍目镜，20倍物镜显微镜下观察酵母母细胞产生的子细胞个数：随机选取40个含单个酵母母细胞的菌落，观察其周围的子细胞个数并记录，通过和阴性、阳性对比，统计分析，评价样品活性。
2.3. 数据统计与分析
通过SPSS(Statistic Package for Social Science)统计软件，对每个样品的40个数据进行分析，计算各组的酵母平均寿命值，并对各加样组与阴性对照组进行一对一的T-检验，P值小于0.05则样品的活性与对照组相比具有显著性差异。
3. 结果与讨论
3.1. 玛咖超临界提取粉末中活性物质的分离、纯化
在玛咖超临界提取粉末(15 g)中加入120 ml 50%甲醇水混合溶剂，震荡后3000 rpm 离心10 min，上清液经ODS柱层析分离(溶剂体系体积比为甲醇:水= 5:5, 7:3, 10:0)，根据TLC结果合并得到4个组分。分别对这四个组分进行抗衰老活性测定，结果显示第3个组分(洗脱溶剂体系体积比为甲醇:水 = 10:0)具有显著延长酵母突变株复制性寿命的活性。故对该活性组分继续进行正相硅胶柱色谱分离(硅胶200 - 300目，溶剂体系体积比为正己烷:乙酸乙酯 = 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 3:7, 0:10)，根据TLC结果合并得到4个组分并进行了活性测试，随后对活性部位第2个组分(正己烷:乙酸乙酯 = 8:2)进行两次HPLC纯化，第一次纯化条件为：色谱柱Capcell PAK C18(f10/250 mm)，流速3 mL/min, 检测波长210 nm, 流动相90%甲醇-水混合溶剂，得到活性馏分(tR = 21.6 min)；第二次纯化条件为：色谱柱Develosil PH-HG-5(f10/250 mm)，流速2 mL/min, 检测波长210 nm, 流动相90%甲醇-水混合溶剂，得到活性化合物1(1.8 mg, tR = 9.3 min)(图1)，发现该化合物在浓度为3 μM和10 μM时均能显著延长酵母的复制性寿命(图2(a))。之后，对进行了正向硅胶柱色谱分离的第4个活性组分(正己烷:乙酸乙酯 = 7:3)进行反相ODS柱层析分离，得到活性化合物2(1.6 mg)(图1)，发现该化合物在浓度为3 μM时能显著延长酵母的复制性寿命(图2(b))。
3.2. 玛咖超临界提取粉末中活性物质的结构鉴定
活性化合物(1)：白色粉末，MS: m/z 372 [M+H]+。根据其1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ：7.28 - 7.35 (m, 5H), 5.66 (s, 1H), 5.35 (m, 2H), 4.45 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 2.21 (m, 2H), 2.02 (m, 4H), 1.66 (m, 2H), 1.27 - 1.30 (m, 20H), 0.88 (t, 3H, J = 6.5 Hz). 将1H-NMR与文献 [14] 进行比对，基本一致，所以此化合物结构初步确定为n-benzyl-(9Z)-octadecenamide(图1)。
活性化合物(2)：白色粉末，MS: m/z 318 [M+H]+。1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ：7.27-7.35 (m, 5H), 5.66 (br s, 1H), 4.45 (d, 2H, J = 5.5 Hz), 2.21 (t, 2H, J = 7.5 Hz), 1.65 (m, 2H), 1.25 - 1.30 (m, 20H), 0.88 (t, 3H, J = 7.0 Hz). 将1H NMR与文献 [15] 进行比对，完全一致，所以此化合物结构确定为n-benzylmyristamide(图1)。
Figure 1. Chemical structures of n-benzyl-(9Z)-octadecenamide (1) and n-benzylmyristamide (2)
图1. n-benzyl-(9Z)-octadecenamide (1)及n-benzylmyristamide (2)的化学结构
3.3. 活性化合物1的合成
将油酸(141 mg，0.5 mmol)溶于5 mL无水二氯甲烷中，在0℃下加入新戊酰氯(181 mg, 1.5 mmol)，室温搅拌1 h后，加入DMAP(74 mg, 0.6 mmol)和苄胺(82 μL，0.75 mmol)，继续搅拌3 h后，加少量水停止反应(图3) [15] 。减压浓缩后将产物溶于30 mL乙酸乙酯中，分别用饱和碳酸氢钠，稀盐酸溶液洗涤，之后，有机层用无水硫酸钠干燥，经减压浓缩得无色透明油状物，该油状物经硅胶柱分离(正己烷:乙酸乙酯 = 7:3)得白色固体(102 mg)，该白色固体经HPLC纯化(甲醇:水 = 98:2)得无色固体(75 mg)。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ: 7.27~7.35 (m, 5H), 5.75 (s, 1H), 5.34 (m, 2H), 4.44 (d, 2H, J = 5.7 Hz), 2.20 (t, 2H, J = 7.3 Hz), 2.00 (m, 4H), 1.65 (m, 2H), 1.26 - 1.30 (m, 20H), 0.88 (t, 3H, J = 6.9 Hz)。生物活性测试结果表明该合成化合物在浓度为3 μM和10 μM时能显著延长酵母的复制性寿命，与天然来源的化合物活性一致。因此确认活性化合物1的结构确定为n-benzyl-(9Z)-octadecenamide。
4. 结论
在K6001酵母活性筛选系统的引导下，对韩国圃美多公司来源的多个产品的抗衰老活性进行筛选，发现玛咖超临界提取粉末具有较好的抗衰老活性，因此对该原料中的抗衰老活性物质进行了研究，通过正、反相柱分离，以及HPLC纯化，得到两个具有显著抗衰老活性的化合物。通过波谱解析及有机合成，确定活性化合物1的结构为n-benzyl-(9Z)-octadecenamide(1)，活性化合物2的结构为n-benzylmyrista- mide(2)。本研究结果表明圃美多公司来源的咖超临界提取粉末具有显著的抗衰老活性，该活性化合物在更高级别生物模型中的作用效果及作用机制有待进一步的研究。
Figure 3. Synthesis of n-benzyl-(9Z)-octadecenamide (1)
图3. n-benzyl-(9Z)-octadecenamide (1)的合成
致 谢
主要由韩国圃美多公司资助，部分获得国家自然科学基金(No. 21661140001)支持。
NOTES
*通讯作者。