摘要:
目的：为了探讨不同动物来源中粪肠球菌(E.faecais)菌株之间的遗传关系。方法：利用PCR技术对59株不同来源粪肠球菌的7个管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yiqL分别进行扩增测序，根据测序结果，利用多位点序列分型技术(Multilocus Sequence Typing, MLST)进行分析、比对。结果：59株不同来源粪肠球菌被分成了27个序列型(Sequence type, ST)，其中，主要流行序列型是ST-16 (占16.9%)，其次是ST-163 (占6.8%)、ST-238 (占6.8%)和ST-631 (占6.8%)，而与医院内感染密切相关的ST-16序列型，广泛分布在除熟食食品和羊粪外的其它5种来源中。另外，猪和蜂猴的粪便中分别含有7种序列型，且均有ST-16序列型。结论：多种动物来源中均含有感染人的粪肠球菌序列型，这也为粪肠球菌致病机理研究奠定了基础。
Abstract:
Objective: To explore the genetic relationships of E.faecais originating from different animal origions. Methods :The seven housekeeping genes including gdh, gyd, pstS, gki, aroE, xpt and yiqL of all 59 E.faecais originating from different animal origions were amplified by PCR method and sequenced, respectively. The sequences were analyzed by multilocus sequence typing technique (Multilocus Sequence Typing, MLST). Results: The 59 E.faecais were divided into 27 sequences type (Sequence type, ST), among them, the major epidemic sequence was ST-16 (16.9%), followed byST-163 (representing 6.8%), ST-238 (6.8%) and ST-631 (6.8%), and is closely related to nosocomial infection of ST-16 sequence type, the ST-16 Sequence type associated with clinical infection were widely distributed in slow loris, chicken-origin, lesion viscera, fresh pork and pig dung. Additionally, seven sequences type were widely distributed in the pig and slow loris stool. And, all of them have ST-16 sequence type. Conclusion: A variety of animal sources contain the dung enterococcus sequence of infected people, it also laid the basis for study of pathogenesis in E. faecalis.
1. 引言
肠球菌(Enterococcus)是一种条件致病菌，可引起严重的医院内感染和感染多种动物 [1] [2] ，其中，粪肠球菌引起的感染占85%~95% [3] 。引起的主要症状包括尿路感染、腹腔感染、败血症、心内膜炎、腹泻等 [2] [4] [5] 。但目前肠球菌的致病机理不清，各感染菌株携带的毒力因子和抗生素抗性不同，尤其是在食品安全日趋严峻的形势下，动物源粪肠球菌与人的感染关系不明 [1] [3] 。因此，了解各来源粪肠球菌遗传关系就成为首要条件。
多位点序列分型(MLST)是1998年Achtman等提出并发展起来的分子生物学分型方法，是通过使用标准的核苷酸测序技术，通过分析多个管家基因450 bp左右的核心片段的核酸序列，从而对菌株的等位基因进行多样性的比较，根据不同的菌株对应不同的序列型来说明其遗传学关系 [6] [7] [8] 。由于MLST操作简单，实验重复性高，它有一个庞大的数据库，可将数据结果直接提交到数据库中进行国际间菌株比对、溯源分析、遗传进化分析等，这对研究不同来源、不同菌株、动物源与人类感染之间菌株的遗传关系和抗生素抗性、流行株、毒力基因携带等之间的相关性奠定了基础 [6] [9] - [14] 。因此，本试验将不同来源59株粪肠球菌利用7个管家基因进行多位点序列分析，根据得出不同的序列型来进行不同来源、不同菌株的遗传关系分析，以期为研究粪肠球菌致病机理奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. 菌种
59株试验菌种为本实验室保存菌种，且均通过16S rRNA方法鉴定，确认59株菌种均为粪肠球菌，并于50%甘油中−20℃保存，其来源与菌株编号如下表(表1)所示。
Table 1. The source of the enterococcus faecalis isolates
表1. 粪肠球菌分离株的来源
注：菌株的NCBI accession number为：N1 (FJ378656), N2 (FJ378657), N4 (FJ378659), N5 (FJ378660), N7 (FJ378662), N8 (FJ378663), N9 (FJ378664), N10 (FJ378665), N12 (FJ378667), N30 (FJ378685), N33 (FJ378688), N41 (FJ378696)
2.2. 主要试剂
PCR反应试剂：DL2000 DNA Ladder Marker、Agarose-Molecular Biology Grade琼脂糖购自宝生物工程(大连)有限公司；TaqPCR Mastermix和Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程有限公司；DNA Green核酸染料购自北京天恩泽生物技术有限公司；BHI培养基；1 × TAE电泳缓冲液；无水乙醇；异丙醇和双蒸水等。
2.3. 操作过程
2.3.1. 细菌的活化与纯化培养
将保存的菌种活化后无菌条件下划线于BHI琼脂平板上，
37 ℃
培养24~48 h。挑取单个菌落，接种于5 ml液体BHI培养基中，37℃培养12小时。
2.3.2. DNA的提取
将上述培养好的菌液按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒说明书进行DNA的提取。
2.3.3. PCR引物设计与合成
根据www.mlst.net网站确定粪肠球菌的7对管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL作为目标基因，应用软件Premier 5.0设计引物(见表2)，并送往上海生工生物工程有限公司合成，按照各引物的分子量将引物稀释为20 pmol/μl，−20℃保存备用。
2.3.4. PCR反应体系及扩增条件
对59株粪肠球菌进行单独扩增：模板DNA 2 μl(空白对照为双蒸去离子水2 μl)，上、下游引物各1 μl (20 pmol/μl)，Taq酶10 μl，其余用去离子水补足，总体积25 μl。7种基因PCR扩增条件均为：
94 ℃
预变性5 min，
95 ℃
变性30 s，56℃退火30 s，
72 ℃
延伸1 min，共进行30个循环；
72 ℃
延伸7 min。
2.3.5. PCR扩增产物测序
将经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后的PCR产物，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。
2.3.6. MLST数椐分析
测序后在线递交到肠球菌MLST分析网络服务器进行分析得出等位基因型和序列型(ST)。
Table 2. PCR primer sequence and the gene length
表2. PCR引物序列与目的基因长度
3. 结果与分析
3.1. PCR产物扩增结果
根据上述引物、扩增条件，以59株粪肠球菌DNA为模板进行PCR扩增，59株粪肠球菌均获得了gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL 7个基因片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳，大小与预期大小一致，详见图1和图2。
3.2. 59株粪肠球菌MLST分析结果
将59株粪肠球菌的7个管家基因gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt和yiqL的扩增产物送基因公司测序，测序结果在国际MLST网络数据库中比对分析，结果59株粪肠球菌被分成了27个ST型，详细结果见表3。通过对27个序列型分析，ST-16序列型最多，占总数的16.9%，其次是ST-163、ST-238、ST-631序列型，分别占6.8%，ST-69、ST-138、ST-330、ST-597序列型分别占5.1%。
从ST序列型和菌株来源关系分析，ST-16序列型的菌株来源较广，在猪病变内脏、生鲜肉样、猪粪、蜂猴、鸡源均有分布；从菌株来源中所含的ST序列型分析，猪病变内脏、猪粪和蜂猴来源的菌株分别均含有7个ST型，其中，猪病变内脏和猪粪便中均含有ST-16和ST-330两个序列型；而猪粪便和蜂猴粪便则分别含有ST-16和ST-225两个序列型。除过ST-16外，其他来源的菌株中则不含有相同的序列型。
4. 讨论
肠球菌广泛的分布性与环境抵抗力以及它的抗药性和致病性，都使得人们对肠球菌越来越重视，而对来源、菌株与抗性和毒力因子携带等遗传关系的研究，以试图为肠球菌致病机理研究打下基础已成为当今研究的一大热点 [1] [15] [16] 。MLST可通过揭示管家基因的变异来揭示病原菌之间遗传关系，且操作十分简单，分型结果具有高度的可重复性及可比性 [3] 。
Figure 1. PCR amplification products of 7 housekeeping genes in enterococcus faecalis. M: DL2000DNA Marker 1: gdh gene; 3: gyd gene; 3: pstS gene; 4: gki gene; 5: aroE gene; 6: xpt gene; 7: yiqL gene; 8: blank control
图1. 粪肠球菌7个管家基因的PCR扩增结果。M：DL2000DNA Marker 1：gdh基因 2：gyd基因 3：pstS基因 4：gki基因 5：aroE基因 6：xpt基因7：yiqL基因 8：空白对照
Table 3. MLST data analysis of 59 dung enterococcus strains
表3. 59株粪肠球菌的MLST数据结果
注：N8…表示N8, N9, 14-2b, F8, 6-6, 6-7, 9-5, 9-8, 2-9, 44B; S7…表示S7, S15, S18, S19; 4-1b…表示4-1b, 12b, 16-1b, 27-2b; 2-11…表示2-11, 22A, 41B, 34A
Figure 2. PCR amplification products of part of the housekeeping gene in enterococcus faecalis. M: DL2000DNA Marker; 1, 2, 3: gki gene; 4, 5, 6: pstS gene; 7, 8, 9: aroE gene; K: blank control
图2. 部分管家基因PCR扩增结果。M：DL2000DNA Marker 1, 2, 3：gki基因4, 5, 6：pstS基因7, 8, 9：aroE基因 K：空白对照
ST-16序列型在本次分型试验中占16.9%，共包括了10个菌株，而且菌株来源广泛，在猪病变内脏、生鲜肉样、猪粪、蜂猴和鸡源中均有分布。而且也是医院内的感染菌株 [17] [18] ，ST-16序列型虽对万古霉素、替考拉宁、莫西沙星等药物敏感，但含有氨基糖苷类抗性基因aac(6′)-Ie-aph(2″)-Ia, aph(3′), ant(6), ant(3″)(9)在ST-16中能被频繁地检测到，且对庆大霉素有较强的耐药性。ST-16在西班牙、荷兰、丹麦、波兰和匈牙利等多个国家均有分布 [17] 。因此，从ST-16序列型感染和分布情况分析，ST-16很可能是一种在不同国家、不同来源间流行的感染菌株，而且有可能携带氨基糖苷类抗性基因，具体情况有待进一步研究。
肠球菌引起的临床感染的治疗越来越困难，其原因除了具有复杂的耐药机制外还有其具有众多的毒力因子，肠球菌的毒力因子已被确认为是这种微生物在宿主上生存及致病性的重要因素 [17] [19] 。据了解，cyl基因的存与ST-16具有一定的联系，而且esp、gelE和agg基因的存在不针对任何特定的ST, 但在ST-16中，却同时含有esp阳性和esp阴性菌株 [16] 。因此，ST-16在动物源性粪肠球菌中是否存在这种毒力因子关系，需要进一步研究。
ST-163、ST-238序列型各自占总数的6.8%，这两个序列型菌株均来源肉制品中，ST-163主要出现在熟肉制品中，ST-238则来源于生鲜肉样中，而且在其他的来源中均没有出现。这说明熟肉制品和生鲜肉中污染的本型菌株来源于其它来源，如环境污染，提示我们应加强环境卫生，避免污染，并应加强加强食品中对ST-163和ST-238的监控。
本次研究主要着重于各菌株间的遗传关系研究，下一步工作将是将这种分型与各菌株表型特性进行结合，以便更好地为致病性、耐药性以及防治打下基础。
NOTES
*通讯作者。