1. 引言
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原发性肝癌的主要类型，约占肝癌的85%~90%，在人类恶性肿瘤死亡原因中位居第三，半数以上病例死于中国，5年生存率8.9% [1] [2] [3] 。局部浸润和远处转移是影响HCC患者生存的重要因素，与多种基因及其蛋白产物的表达异常有关 [2] - [11] 。本文采用免疫组化染色EliVisionTM plus二步法检测140例HCC组织白细胞分化抗原44变异体6 (CD44v6)和纤黏连蛋白(Fibronectin, FN)的表达，探讨它们之间的相关性，结合临床随访资料分析其表达与HCC浸润、转移和患者预后的关系。
2. 资料与方法
2.1. 一般资料
本研究的病例来自2000年11月至2011年2月在中国人民解放军第251医院手术切除的原发性HCC标本140例，其中男90例，女50例；年龄27~73岁，平均年龄(48.6 ± 8.8)岁。肉眼形态：巨块型63例，结节型54例，弥漫型23例。肿瘤大小：≤5 cm 48例，>5 cm 92例。按Edmondson分级标准I~II级为高分化癌56例，III~IV级为低分化癌84例。伴有淋巴结、肝内、肝外转移者63例，无转移者77例。140例HCC患者中随访满5年者84例，其中死亡62例，存活22例。选取距癌灶
2cm
的癌旁肝组织30例和尸检正常肝组织10例作为对照。研究方案通过医院伦理委员会批准，所有患者及家属均签署知情同意书。
2.2. 纳入标准
1) 原发性HCC，手术切除后病理诊断确诊。
2) 年龄 ≥ 18岁，≤80岁。
3) AFP ≥ 400 µg/L，并能触及肝脏肿块或影像学检查有肝癌特征的占位性病变。
4) AFP < 400 µg/L，并有两种影像学检查有肝癌特征的占位性病变或有两种肝癌标志物(AFP异质体，异常凝血酶原，γ-谷氨酰转肽酶同工酶II及α-L-岩藻糖苷酶等)阳性及一种影像学检查有肝癌特征的占位性病变。
5) 术前未曾接受过介入治疗、射频及其它间质治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗、中药治疗及生物靶向治疗等。
2.3. 排除标准
1) 术前肝穿刺活检或手术切除后病理诊断为原发性胆管细胞癌。
2) 转移性肝癌。
3) 肝肉瘤或肝肉瘤样癌等其它少见恶性肿瘤。
4) 年龄 < 18岁，>80岁。
5) 术前曾接受过抗癌治疗措施。
6) 妊娠患者。
7) 活动性肝病或其它严重肝肾疾病。
8) 其它系统性疾病。
2.4. 免疫组化染色方法
手术标本均行常规HE染色。取相邻切片行免疫组化染色。即用型鼠抗人CD44v6和FN单克隆抗体、EliVision试剂盒和二氨基联苯胺显色剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司。所有标本均经10%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规制备4 μm厚连续切片，65℃烘烤备用。采用EliVisionTM plus二步法，主要操作步骤 [12] [13] [14] [15] [16] ：① 石蜡切片脱蜡至水，微波(micro-wave, MW) 5 (输出功率90 W，下同)档，磷酸盐缓冲液(PBS)洗1 min × 3；② 微波-枸橼酸钠缓冲液(0.01 mol∙L−1, PH 6.0)修复抗原，MW3档(输出功率150 W) 2 min，MW5档2 × 5 min，自然冷却至近室温时自来水洗，PBS洗1 min × 3；③ MW5档，在甲醇-双氧水中封闭内源性过氧化物酶2 min，PBS洗1 min × 3；④ 加一抗，4℃冰箱过夜，从冰箱中取出后，MW5档5 min，PBS洗2 min × 3；⑤ 加聚合物增强剂，室温下孵育20 min，PBS洗2 min × 3；⑥ 加生物素化鼠抗人IgG (1:300)，37℃、30 min，MW5档5 min，PBS洗2 min × 3；⑦ 3,3'-二氨基联苯胺(Diaminobenzidine, DAB-H2O2)显色10 min；自来水终止显色；⑧ 苏木素复染0.5~1.0 min；⑨常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以公司提供的已知CD44v6和FN阳性染色切片作阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照。
2.5. 判定标准
阳性颗粒呈棕黄色或棕褐色，由2位有经验的病理医师在光学显微镜下进行双盲观察，按染色深浅强度评分：无染色0分，棕黄色1分，棕褐色2分；按染色癌细胞所占比例评分：≤30% 1分，31%~70% 2分，≥71% 3分。每例按两项评分之和定性：0分阴性(−)，1~3分弱阳性(+)，4~6分强阳性(++)。弱阳性和强阳性均计为阳性。
2.6. 统计学处理
数据资料应用SPSS17.0统计软件进行χ2检验及相关分析，检验水准α = 0.05。
3. 结果
3.1. CD44v6和FN在HCC组织、癌旁肝组织和正常肝组织中的表达
CD44v6阳性染色主要见于细胞质和细胞膜，FN阳性染色主要见于细胞膜和细胞质。HCC组织 140例中CD44v6和FN阳性率分别为42.9% (60/140)和35.7% (50/140)。癌旁肝组织30例中CD44v6弱阳性表达3例(阳性率10%)，FN均呈不同程度的阳性表达(阳性率100%)。正常肝组织10例中CD44v6均阴性，FN均呈不同程度的阳性表达。χ2检验，CD44v6阳性率在HCC中显著高于癌旁肝组织和正常肝组织(χ2 = 11.435, χ2 = 7.143, P < 0.05)，FN阳性率在HCC中显著低于癌旁肝组织和正常肝组织(χ2 = 40.982，χ2 = 16.071, P < 0.05)。
3.2. CD44v6和FN表达与HCC临床病理特征的关系
两者表达在不同性别、年龄、肿瘤肉眼形态及大小之间差异无统计学意义(P > 0.05)，在不同分化程度及有无转移之间差异有统计学意义(见表1)。
3.3. CD44v6和FN表达与HCC预后的关系
在随访满5年的患者中，CD44v6阳性者死亡率高，生存率低；FN阳性者死亡率低，生存率高(见表1)。
3.4. CD44v6和FN表达之间的关系
在CD44v6阳性表达的60例HCC中，FN阳性表达4例(6.7%)，在CD44v6阴性的80例HCC中，FN阳性表达46例(55.5%)。CD44v6与FN表达呈显著负相关(P < 0.05, r = −0.46)。
Table 1. The relationships between the expression of CD44v6 and FN and clinicopathologic feature of HCC
表1. CD44v6和FN表达与HCC临床病理特征的关系
注：与高分化组比较*P < 0.05；与无转移组比较△P < 0.05；与生存组比较#P < 0.05。
4. 讨论
癌基因研究结果发现，恶性肿瘤发生发展的各个时期至少有两种或两种以上功能不同的癌基因或抑癌基因的异常表达，前者的激活及后者的突变失活等发挥了不同作用，协同促进细胞癌变。HCC发病隐匿，恶性度高，侵袭力强，细胞与细胞或细胞与基质之间黏附特性的异常在浸润和转移过程中发挥了重要作用。近年已发现不少包括甲胎蛋白(AFP)在内的与HCC发生发展、浸润转移相关的肿瘤标志物，其应用价值在临床诊疗中不断得到肯定。
CD44是一种整合膜糖蛋白，作为淋巴细胞的归巢受体和透明质酸酶的主要受体，能连接细胞基质中的FN、层黏蛋白、I型胶原、透明质酸以及骨架蛋白，参与细胞伪足形成，导致细胞形态和游动性改变。CD44v6是CD44的一种拼接变异体，其表达可改变肿瘤细胞表面黏附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能。CD44v6的高表达与胃癌、结肠癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤的发生发展、浸润转移密切相关，被认为是一种独立的预后指标 [17] [18] ，与HCC分化程度及临床分期密切相关 [6] [7] [8] 。FN是一种多功能基质糖蛋白，为基质和基底膜的主要黏合蛋白成分，介导了细胞间及细胞与细胞外基质的相互黏附作用，是维持机体完整性及防御机制的重要物质，在胶原合成、调节网状内皮系统功能、维持内环境平衡、修复肝细胞损伤等方面具有重要作用，其表达水平可反应肝细胞受损程度，与肝硬化及HCC的发生发展相关 [9] [10] 。细胞FN和基膜FN的减少和缺失，可导致癌细胞黏附性下降，通过破坏基底膜，逃脱周围束缚，发生浸润和转移。
本组研究资料表明，CD44v6在癌旁肝组织中仅少量呈弱阳性表达，在正常肝组织中均为阴性表达，FN在癌旁肝组织及正常肝组织中均呈不同程度的阳性表达。在HCC组织中CD44v6阳性率显著高于癌旁肝组织和正常肝组织，FN阳性率显著低于癌旁肝组织和正常肝组织。CD44v6表达阳性的HCC分化程度低，转移率高，患者5年生存率低，FN阳性表达的HCC分化程度高，转移率低，患者5年生存率高，表明CD44v6表达上调和FN表达下调与HCC分化程度、浸润转移及患者生存期密切相关。笔者还观察到，在HCC组织中两者表达呈显著负相关，提示它们在HCC恶性发展过程中可能具有相互诱导或负调控的协同作用。联合检测CD44v6和FN有助于了解其临床病理进程，提高对其生物学特性、尤其是浸润能力和转移潜能的判断水平。深入研究它们在HCC中的作用机制，对评估患者预后、随访中及时发现复发、指导临床采用再手术或其它抗癌治疗综合措施具有一定指导意义 [19] [20] 。
5. 结论
CD44v6和FN表达与HCC分化程度、浸润转移和患者生存期密切相关，联合检测CD44v6和FN蛋白表达可作为判断HCC预后有价值的参考指标。