1. 引言
鲤春病毒(Spring Viremia of Carp Virus, SVCV)是一种弹状病毒，主要发生于春季，它可以引起鲤科鱼类的鱼苗或成鱼大规模暴发鲤春病毒血症(SVC)。SVC又称鲤鱼传染性腹水症，是一种急性、出血性传染性败血病。该病可以危害鲤鱼，鲶鱼，鲫鱼，鲢鱼，鳙鱼等，在欧、亚两洲均有流行。SVCV是鱼类口岸检疫的第一类检疫对象，世界动物卫生组织(OIE)将其列为需要向申报的疫病，我国农业部定为一类动物疫病 [1] 。
SVCV传统检测方法是根据典型症状进行初步诊断，再通过细胞分离病毒进行确认，最后采用免疫学方法，如中和试验和ELISA，或者分子生物学方法，如PCR和DNA探针等进行鉴定 [2] 。原位杂交法可以对组织切片中不同细胞、不同部位靶基因进行精确定位，具有特异性强、灵敏度高等特点，可以作为一种很好的水生动物病毒定位检测方法 [3] 。本文利用SVCV核蛋白基因的高保守高特异性，采用巢式PCR扩增出714 bp片段，地高辛(DIG)标记探针，建立测定SVCV的ISH方法，初步确定SVCV在病鱼体内存在的部位，为进一步研究SVCV的发病机理提供了基础材料。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 毒株
传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、鲤春病毒(SVCV)、流行性造血器官坏死病毒(EHNV)等毒株由本实验室保存。
2.1.2. 实验样品
人工感染的鲤鱼鱼苗为市场购买。
2.1.3. 仪器和试剂
显微镜：德国蔡氏AXIOPHOT显微镜。
试剂盒：Roche生产的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，DIG Wash and Block Buffer。
2.2. 实验方法
2.2.1. 病毒液的制备
利用FHM细胞对SVCV病毒的敏感性体外扩增SVCV病毒，并用Karber法测定病毒滴度为10−6.127/0.1 mL。
2.2.2. 人工感染
购买的鲤鱼鱼苗经过一周饲养确定没有病变症状，将20条鱼分成2组(对照组和实验组各10条)。将2组鱼饲养在10℃水箱中，将病毒液按1:1000比例投入实验组，适应性感染3 d。用滴度为105左右的SVCV病毒液5 μL对实验组斑马鱼进行背鳍基部肌肉注射，进一步强化。注射后每天观察记录染毒鱼的状态，并持续饲养直至实验组出现明显的病变症状。
2.2.3. 引物设计
根据文献设计引物并合成(见表1)。
2.2.4. 病鱼的PCR鉴定
对出现典型症状的病鱼提取病毒RNA，进行PCR鉴定。
2.2.5. 探针的制备
1) 制作模板DNA：病毒液提取病毒RNA，利用设计的引物扩增出一条714 bp的片段。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。按照凝胶回收试剂盒说明对PCR扩增出的714 bp片段进行回收。
2) DIG标记：按照DIGDNA高效标记检测试剂盒说明，将回收的714 bp片段标记成DIG-714探针。
3) 探针浓度的选择：按照DIGDNA高效标记检测试剂盒说明，选择适合的探针浓度。
2.2.6. 切片的制作
实验组病鱼经10%甲醛固定24 h后，分成头部、内脏和尾臀三部分。经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，最后石蜡包埋。切片待检。头部取脑、眼处横切片，内脏部取内脏部分中间处切片，尾臀取有最大横切面积的切片。
2.2.7. ISH检测
将载有病鱼切片的玻片60℃恒温45 min水化，随后经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；加入含100 mg/L蛋白酶K的PBS，37℃消化15 min；预冷的0.4%甲醛室温固定5 min；2 × SSC (0.3 M NaCl，0.03 M枸橼酸钠，pH7.0)室温漂洗5 min；500 μL预杂交液(4 × SSC，50%甲酰胺，0.02% BSA，0.02%聚蔗糖，0.02% PVP，5%硫酸葡聚糖) 37℃预杂交30 min；DIG-714探针溶液稀释到1 ng/μL
42 ℃
杂交2 h。依次
37 ℃
，2 × SSC漂洗30 min，1 × SSC漂洗5 min，0.5 × SSC漂洗5 min；室温Buffer I (0.1 MTris-HCl，0.15 M NaCl，pH 7.5)洗片5 min；37℃加入500 μL含5% 阻断剂的Buffer II阻断15 min；37℃加入500 μL含有1/1000
表1. SVCV RT-PCR引物
抗DIG碱性磷酸酶复合物中孵育30 min；室温Buffer I洗片10 min，Buffer III (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9.5)平衡5 min；滴加500 μL显色液(75 mg/mL NBT, 50 mg/mL BCIP)，室温避光显色3 h；室温Buffer IV终止反应15 min；0.5%皮斯麦棕复染色5 min。梯度乙醇脱水，二甲苯置换10 min。树胶封片镜检。可见阳性信号成紫色。结果用照片显示。同时设置阴性对照：以对照组健康鲤鱼鱼苗为材料制作切片，完全按照上述方法进行检测。
3. 结果与讨论
3.1. 探针的制备
以SVCV胶回收产物作为模板，并对回收产物进行浓度测定，平行测定两次取平均值作为探针模板的浓度(表2)。计算结果SVCV的模板浓度是352.15 ng/μL。
按照罗氏DIG-DNA高效标记检测试剂盒的说明进行模板DNA标记，DIG标记后两种探针浓度均为100 ng/μL。
3.2. 探针浓度的选择
在硝酸纤维素(NC)膜上进行斑点杂交反应选择探针的浓度，结果如图表明。图1显示，DIG探针在0.1 pg/μL显示的亮度与对照组1 pg/μL稀释的亮度相当，表明原标记液中探针的含量高于理论值，按照DIG标记效率曲线关键点推算出大约为2300 ng。在做Southern blot时，使用稀释至25 ng/mL的杂交液，做组织切片杂交实验时使用稀释至1 ng/μL的杂交液。
3.3. 探针特异性检测
图2为转膜前电泳检测结果，以714 bp的SVCV、224 bp的IPNV、505 bp的VHSV、580 bp的EHNV作为对照组，得到相应的目的条带。
图3为SVCV探针特异性southern blot杂交结果图，1号SVCV出现杂交结果，且信号强度良好，而其他样品均没有杂交信号，说明探针与其他样品无杂交反应，对SVCV具有良好的特异性。
3.4. ISH结果
人工感染草鲤鱼的SVCV探针ISH检测结果(图4)与对照组健康鱼ISH检测结果(图5)对比显示，在
Table 2. Concentration of template DNA
表2. SVCV模板浓度
Figure 1. Quantification of labeling efficiency with DIG-SVCV; C: Positive control; 1,2: DIG-SVCV
图1. SVCV探针浓度的选择；C：阳性对照；1,2：标记的DIG探针
Figure 2. Electrophoresis map for RT-PCR product; M: Marker 2000; 1: SVCV714 bp; 2: ipnv224 bp; 3: VHSV505 bp; 4: EHNV580 bp
图2. PCR产物电泳图；M：Marker 2000；1：SVCV714 bp；2：ipnv224 bp；3：VHSV505 bp；4：EHNV580 bp
Figure 3. The result of DIG-SVCV Southern blot hybridization; M: Marker 2000; 1: SVCV714 bp; 2: ipnv224 bp; 3: VHSV505 bp; 4: EHNV580 bp
图3. SVCV探针特异性southern blot杂交结果图；M：Marker 2000；1：SVCV714 bp；2：ipnv224 bp；3：VHSV505 bp；4：EHNV580 bp
内脏、眼、脑、肌肉组织切片中均检测到了深紫色的阳性信号斑点(显微照片中为黑色小圆形斑点，能够明显的与组织复染后照片中的颜色区分)。其中，整个脑、肌肉组织的阳性斑点较多，眼组织中也可观察到较少的阳性信号，但总体信号较弱。
对健康草鲤鱼切片进行SVCV探针混合液的ISH，显微结果(图5)表明健康鱼各组织切片中均没有出现杂交斑点，证明病鱼组织切片中的蓝紫色斑点是病鱼组织中SVCV与探针产生的杂交斑点。
4. 结论
ISH是分子生物学与组织学相结合的一种技术，它从细胞水平上研究特异核酸的分布、数量以及与细胞分化、生理、病理状态、形态特征演化之间的关系，可在受染细胞内显示特定病毒的DNA序列，为病毒的组织细胞定位提供了一个更为有效的方法。ISH技术在医学上应用很广泛 [4] ，并且BP、IHHNV
Figure 4. The result of ISH with DIG-SVCV for infected samples A: internal organs; B: brain; C: eyes; D: muscle
图4. SVCV感染草鲤鱼组织石蜡切片ISH结果图A：内脏；B：脑；C：眼；D：肌肉
Figure 5. The result of ISH with DIG-SVCV for healthy samples A: internal organs; B: brain; C: eyes; D: muscle
图5. 健康草鲤鱼组织石蜡切片ISH结果图 A：内脏；B：脑；C：眼；D：肌肉
等核酸探针已商品化，为SVCV的检测提供了有利工具。ISH靠探针的渗透作用进入细胞内与特异的核酸片段杂交。探针长度影响其渗透力，从而使结果产生偏差，甚至可能出现假阴性结果。据报道，大致700 bp探针有良好的渗透力 [5] 。
本文根据糖蛋白基因设计的特异性引物，对SVCV进行扩增，并对扩增产物进行DIG标记，得到探针DIG-714。通过比较对照标记反应产生的点的强度差异，计算出DIG标记DNA的量，SVCV探针稀释至0.1 pg的点与对照DNA的点均可见，说明标记的探针达到了预期的标记效率，按照标记效率曲线关键点推算出大约为2300 ng。在做Southern blot时，使用稀释至25 ng/mL的杂交液，做组织切片杂交实验时使用稀释至1 ng/μL的杂交液。探针的特异性实验结果表明，两种探针能够标记相应的病毒，对其他的对照组并没有交叉反应，DIG-SVCV特异性良好。人工感染实验结果表明，鱼内脏、眼、脑、肌肉组织切片中均检测到深紫色的阳性信号斑点，其中整个脑、肌肉组织的阳性斑点较多，眼组织中也可观察到较少的阳性信号。因此，本文建立的方法是一种用于检测鲤春病毒在感染宿主中的分布、定位、以及细胞和分子病理的有效方法，也适用于其他水生动物病毒的检测和诊断。
基金项目
国家质检公益项目(201410059)。