1. 引言
吡嗪类化合物是白酒中重要的含氮化合物，香气强度高、阈值低，影响着白酒的风味特征 [1] 。在酱香型白酒中已检测出较高浓度的吡嗪类化合物，其中以四甲基吡嗪为主，含量最高 [2] 。吡嗪类化合物在心脑血管系统 [3] 、中枢神经系统 [4] 、呼吸系统 [5] 、消化系统 [6] 、泌尿系统 [7] 等方面也体现出健康功效，具有扩张血管，改善微循环及抑制血小板聚集、保护肝脏等功能。吡嗪类化合物既是白酒中重要风味物质也是健康功效因子，对其分析研究具有重要意义。
白酒中吡嗪类物质的浓度是mg/L (ppb)级，所以对白酒中的吡嗪类物质进行分析检测时需要建立高效的富集方法 [2] 。主要的富集方法有液液萃取(LLE)、固相微萃取(SPME)、超临界CO2萃取、离子交换等 [1] 。固相微萃取分为两个步骤：吸附和解吸。吸附过程是石英纤维表面的涂层根据相似相溶原理对待测组分进行吸附，将待测组分从基质中分离出来。固相微萃取具有样品用量小，耗时少而且不需要有毒有机溶剂、选择性强、重现性好，精确度高的优点从而得到广泛应用 [8] 。本研究中直接固相微萃取法即顶空固相微萃取法。间接固相微萃取法是在直接固相微萃取法基础上，多了一步对酒样的预处理。利用间接固相微萃取法对浓酱兼香型典型代表白云边年份酒中吡嗪类化合物进行分析，直观体现吡嗪类化合物的变化。
2. 材料与仪器
2.1. 材料与试剂
化学试剂：2-甲基吡嗪(99.99%)、2,3-二甲基吡嗪(99.99%)、2,5-二甲基吡嗪(99.99%)、2,3,5-三甲基吡嗪(99.99%)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(99.99%)、氯化钠、氢氧化钠、硫酸。
白酒样品：3年白云边(150 mL)、12年白云边(150 mL)、白云边30年(150 mL)。
2.2. 仪器与设备
仪器：旋转蒸发仪(RE201D上海精密仪器仪表有限公司)、气相色谱仪(VARIAN 3900美国安捷伦)、质谱仪(5975E美国安捷伦)、50/30umDVB/CAR on PDMS 萃取头(上海安普实验科技有限公司)、SPME手动进样柄(上海安普实验科技有限公司)。
2.3. 实验方法
2.3.1. 吡嗪标准溶液的配制
5种吡嗪标品用去离子水分别配制1 mg/L的吡嗪标准溶液，然后依次稀释成400 ug/L、300 ug/L、200 ug/L、150 ug/L、100 ug/L备用。
2.3.2. 间接固相微萃取法
1) 酒样的处理
取150 ml酒样于烧杯中，用6 mol/L的H2SO4调节其pH值为1。用旋转蒸发仪60℃下蒸发浓缩30 min，收集浓缩液并记录浓缩液体积。用6 mol/L的NaOH调节浓缩液pH值为12。
2) 顶空固相微萃取法
SPME的手动进样柄和50/30 um DVB/CAR on PDME萃取纤维用于吡嗪的萃取。首先将50/30 um DVB/CAR萃取纤维在气相色谱进样口老化30 min，老化温度为250℃。分别取处理好的白酒样品和标准溶液1 mL加入顶空瓶中，然后在顶空瓶中加入氯化钠直到溶液饱和，加入磁体搅拌转子，加盖封口。磁力搅拌加热器2800 r/min 40℃下稳定15 min达到气–液平衡，将老化好的萃取纤维插入顶空瓶的顶空部分(萃取纤维不接触溶液)，在相同的温度下连续搅拌萃取20 min。萃取后将萃取纤维拉入针鞘中，将固相微萃取装置从顶空瓶中取出。
2.3.3. 气相色谱分析
将取出的固相微萃取装置插入气相色谱仪的进样口进行进样，260℃热解吸5分钟，取出固相微萃取装置。气相色谱仪条件为：进样口温度260℃，采用不分流模式进样，初始柱温60℃，以20℃/min速度10 min内升至260℃，载气为氮气，恒定流速为2 mL/min。
2.3.4. 质谱分析
把完成固相微萃取后的固相微萃取装置插入质谱仪的进样口。质谱条件为：电离方式EI，电子能量70 eV，接口温度280℃，阈值100，扫描/秒为2.67，扫描质量数15~600 amu。
2.3.5. 吡嗪定量方法
根据5个不同浓度吡嗪标准液对应的气相色谱图，找到相对应吡嗪色谱峰面积，作出吡嗪色谱峰面积–浓度标准曲线。已知被测酒样气相色谱图中吡嗪色谱峰面积，根据对应吡嗪的标准曲线线性方程计算出处理后的酒样中吡嗪的浓度。
3. 结果与分析
3.1. 固相微萃取的选择
由图1可以看出：酒样直接固相微萃取得到的吡嗪组分峰重叠，主要是因为酒样中会有大量的酸性物质影响吡嗪类化合物的萃取，形成酸性物质物质屏障。对比图1由图2可以看出：间接固相微萃取法可以消除酸性物质干扰，吡嗪组分峰分离明显。所以本实验采用间接固相微萃取法，先对酒样进行预处理，将酒样调至pH为1，蒸馏除去酸性组分，然后将剩余溶液调至pH12。再进行顶空固相微萃取。2,5-二甲基-3-正戊基吡嗪是白云边酒的特征风味成分，后续实验中因缺少其标准品所以未检测。
3.2. 吡嗪色谱峰面积–浓度标准曲线
气相色谱图可得到吡嗪5种浓度标准溶液对应的色谱峰面积，分别对五种吡嗪标准样品的气相色谱
Figure 1. Direct solid phase microextraction of total ion current
图1. 直接固相微萃取总离子流图
Figure 2. Indirect solid phase microextraction of total ion current
图2. 间接固相微萃取总离子流图
峰面积与浓度作出标准曲线，见图3。从表1可看出5种不同吡嗪标准样品的线性相关系数都在0.97以上，可以用于准确定量。根据线性方程可分别计算出酒样中对应吡嗪的含量。
3.3. 白云边年份酒中吡嗪含量变化分析
从图4可以看出30年白云边酒中含有2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪，同样3年、12年、15年白云边酒中也都含有这四种吡嗪。
从表2中数据可以看出：3年白云边酒中2-甲基吡嗪含量最高，浓度为351.503 ug/L，其次为2,5-二甲基吡嗪，浓度为262.288 ug/L，四种吡嗪总含量较低。12年白云边酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，浓度为669.206 ug/L，2-甲基吡嗪和2,5-二甲基吡嗪含量较次之，分别为344.691 ug/L和368.434 ug/L，
Figure 3. Five pyrazines peak area-concentration standard curve
图3. 五种吡嗪色谱峰面积-浓度标准曲线图
Figure 4. 30-year Baiyunbian liquor of the gas chromatogram
图4. 30年白云边酒的气相色谱图
Table 1. Standard curve of five pyrazines
表1. 五种吡嗪的标准曲线表
Table 2. Pyrene content of Baiyunbian liquor in different years
表2. 不同年份白云边酒吡嗪含量
较3年白云边酒，各吡嗪组分含量明显升高。15年白云边酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量最高，浓度为681.626 ug/L，2,5-二甲基吡嗪较次之661.238 ug/L。30年白云边酒中2,5-二甲基吡嗪含量最高，浓度为958.422 ug/L，2,3,5,-三甲基吡嗪较次之，浓度为489.196 ug/L。不同年份白云边酒中4种吡嗪含量不断变化，总含量也不相同。
从图5~9可以看出2-甲基吡嗪含量总体呈下降趋势，12年~15年下降迅速，后又有上升趋势。2,5-二甲基吡嗪含量呈上升趋势，12年~15年上升迅速。2,3,5-三甲基吡嗪含量呈稳步上升趋势，12年~15年上升速度略有增加。2,3,5,6-四甲基吡嗪含量总体趋势为先上升后下降，3年~12年迅速上升，12年~15年上升缓慢，15年~30年迅速下降。4种吡嗪的总体含量呈上升趋势，3年~15年间上升迅速，15年后上升缓慢。
由此可见白云边酒中吡嗪类化合物的含量不断变化，与年份有着密切关系，尤其12年~15年是各类吡嗪含量变化的转折点。吡嗪总含量随年份增长而递增，30年后吡嗪总含量缓慢上升的同时趋于平衡状态。
Figure 5. Variation of 2-Methylpyrazine Concentration in Baiyunbian liquor
图5. 白云边酒中2-甲基吡嗪浓度变化图
Figure 6. Variation of 2,5-dimethylpyrazine concentration in Baiyunbian liquor
图6. 白云边酒中2,5-二甲基吡嗪浓度变化图
Figure 7. Variation of 2,3,5-trimethylpyrazine concentration in Baiyunbian liquor
图7. 白云边酒中2,3,5三甲基吡嗪浓度变化图
Figure 8. Variation of 2,3,5,6-tetramethylpyrazine concentration in Baiyunbian liquor
图8. 白云边酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪浓度变化图
Figure 9. Trends in the total concentration of four pyrazines in Baiyunbian liquor
图9. 白云边酒中四种吡嗪总浓度变化趋势图
4. 结论
本实验采用间接固相微萃取法富集白酒中吡嗪类化合物，联合气相色谱–质谱(GC-MS)联用技术进行检测，采用外标法对白云边酒中吡嗪类化合物的含量进行定量计算。先对酒样进行预处理再进行顶空固相微萃取的间接固相微萃取法消除了酸性物质干扰。数据分析发现：各年份白云边酒中都含有2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪。白云边年份酒中这四种吡嗪的含量不断变化，与年份有着密切关系。尤其12年~15年是吡嗪含量变化的转折点，四种吡嗪总含量随年份增长而递增，30年后吡嗪总含量缓慢上升的同时趋于平衡状态。从吡嗪类化合物角度体现出“酒是陈的香”。
基金项目
国家重点研发计划资助(2016YFD0400501)；湖北省科技支撑计划项目(2015BAA154)；武汉市科技局应用基础研究计划项目(2015020101010074)。