1. 引言
血管内皮细胞(Vascular endothelial cell, VEC)是存在于血管壁与血液之间的天然屏障，不仅参与血管的形成，而且在组织生长、发育过程中也有重要作用 [1] 。VEC主要生理功能有：释放不同的生物活性调节因子调节血管的收缩与舒张；防止血小板的聚集、黏附以及血栓的形成；防止炎性细胞对血管壁的粘附、浸润等。其结构功能的正常对于预防血栓闭塞性血管炎(thromboangiitis obliterans, TAO)等周围血管疾病的发生和发展有着重要意义 [2] 。VEC易受体内外物理、化学因素攻击损伤，引起VEC功能尤其是内分泌功能紊乱，是不少心血管疾病早期表现形式，且与糖尿病、肿瘤等疾病的发生、发展有密切关系 [3] 。VEC是组织细胞培养对象之一，以VEC建立疾病的离体模型，被广泛应用于心血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等领域研究 [4] [5] [6] 。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)是目前国内外研究最常用的内皮细胞。主要考虑HUVEC容易获得和培养，实验重复性好，但是人脐静脉内皮细胞来源于静脉而非动脉。大鼠是一个十分重要的研究模型，繁殖较快，取材方便，且与人相似性较高，但分离培养鼠原代主动脉内皮细胞是比较困难的 [7] 。因此探索建立一套操作简单，实用、重复性良好的大鼠主动脉内皮细胞(rat aortic endothelia cells, RAECs)分离培养方法，具有重要意义。目前国内外常见的获取VEC的方法包括机械刮取法、组织块移植法和酶消化法等，均存在一些不足之处 [4] [5] [6] [7] ，通过对上述方法优缺点的分析，并在参考了大量国内外文献的基础上，经过反复实验，改进了原代大鼠主动脉血管内皮细胞培养方法。并获得了纯度高，活性良好的VEC。为TAO、心血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等领域研究的开展提供了较好的实验素材。现介绍如下。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 主要试剂与仪器
含双抗低糖型RP1640培养基(北京Solarbio科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，PBS (北京中杉生物技术有限公司)，FVIII多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)、荧光标记羊抗兔Ig抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。医用型超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)，CO2培养箱(上海医疗器械厂)，倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)，荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。
2.1.2. 实验动物
清洁级雄性Wistar大鼠2只，体量200~250 g，由南昌大学医学院动物实验中心提供，动物合格证：[南昌大学实验动物中心，编号SCXK(赣)，2008-0001]。
2.2. 实验方法
2.2.1. RAEC s原代培养
Wistar大鼠采用2%戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下打开腹腔，分离并取约3~4 cm主动脉放入含有双抗的PBS中漂洗，用眼科剪和小镊子去除主动脉外周结缔组织及脂肪，并用吸管将动脉管腔残留的血液冲洗干净。将消毒过的除掉针头的缝衣针牵引手术缝合线穿过主动脉管腔，缝合线的远端结扎主动脉的一端。再用血管钳牵引缝合线，同时用镊子夹住血管的另一端轻轻反向下拉使主动脉内膜翻出，将已翻转的主动脉两端向内折入少许，缝合线将主动脉两端结扎，并用在酒精灯上烧热的镊子烫烙动脉两端，使翻转的主动脉两端完全密闭。将翻转封闭的主动脉完全浸入装有2~3 ml的0.125%胰蛋白酶的离心管中，置于37℃水浴锅中，消化18 min，加入等量含10% FBS的培养液中止消化，收集消化液，于1000 r/min离心5 min，弃上清，在底部沉淀的细胞中加入含20% FBS的RP1640培养液重悬，吹打混匀，接种在六孔板内。放入37℃和5% CO2培养箱培养。孵育3~4天时细胞贴壁，再更换培养液。之后每隔2~3 d换液1次，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
2.2.2. RAEC s传代培养
原代培养的RAECs孵育约10~12 d，至贴壁细胞覆盖3/4以上六孔培养板面积，约80%的细胞融合成单层时即可传代。弃培养液，用0.01 mmol PBS液洗涤培养板2次，加入1~2 mL 0.125%胰蛋白酶消化约2~3 min，待镜下见内皮细胞皱缩变圆时，立即加入等量含10%胎牛血清的RP1640培养液终止消化，用吸管轻轻反复吹打使细胞完全脱壁并混匀，转移到10 ml离心管中，室温下以1000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀细胞中加入含10%胎牛血清的RP1640培养液3 mL，轻轻吹打使细胞重悬均匀，倒置相差显微镜下计数，以(2~3) × 105/瓶的密度接种到25 cm2的塑料培养瓶中，置于37℃ CO2培养箱内孵育。根据内皮细胞贴壁时间快于成纤维细胞的特点，传代培养4 h后换培养液可以除去未贴壁杂细胞，以后每2~3 d换液一次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
2.2.3. RAECs的形态学观察
在培养过程中，每天于倒置相差显微镜下观察细胞的生长和细胞形态特征，并拍照。
2.2.4. 免疫组化法鉴定RAECs [3]
取第三代长满24孔培养板的传代细胞，设立实验组和空白对照组，至细胞汇合成单细胞层后，吸去培养液，以0.01M PBS漂洗2次，经40 g/L多聚甲醛固定30 min，用PBS洗3次，体积分数为3%H2O2室温浸泡30 min，以灭活内源过氧化物酶，PBS洗2次，0.3%TritonX-100室温浸泡30 min，PBS洗3次，滴加5% BSA封闭液，室温20 min，甩去多余液体不洗。然后加入稀释(1:100)Factor VIII抗体，4℃湿盒过夜，用PBS洗3次；滴加2抗，室温孵育30 min，PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)室温显色，显微镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，苏木精轻度复染，蒸馏水洗涤，PBS返蓝，在荧光显微镜下观察并摄片。用PBS代替Factor VIII抗体，其余步骤不变，作为阴性对照。
2.2.5. 免疫荧光染色技术鉴定RAECs
取生长于25 cm2的塑料培养瓶第3代细胞，传代接种于24孔培养板，随机分为实验组和空白对照组，至细胞生长融合成单细胞层后，吸去培养液，0.01 mmol PBS漂洗2次，经40 g/L多聚甲醛固定30 min后再用PBS漂洗3次，体积分数为3% H2O2室温浸泡30 min，以灭活内源过氧化物酶，PBS洗2次，0.3% TritonX-100室温浸泡30 min，PBS洗3次，滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体。然后加入1:100稀释的第VIII因子相关抗原FactorVIII-related antigen，FactorVIII)抗体，4℃湿盒过夜。次日用PBS洗3次，滴加用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的IgG抗体，室温置于暗室中30 min，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察染色结果并拍片。
2.2.6. RAECs细胞活力检测
4.0 g台盼蓝中加入少许双蒸水研磨，待台盼蓝充分溶解后定容至100 ml，经滤纸过滤后放4℃保存。临用时加PBS稀释至4 g/L。于RAECs传代过程中每次取50 μl细胞悬液与50 μl的4 g/L台盼蓝混匀，取1滴滴入血球计数板于倒置显微镜下计数200个左右细胞。显微镜下可见活细胞拒染，死细胞被染成淡蓝色。计算活细胞率(%) = 活细胞数/总细胞数 × 100%，此过程重复3次，取平均值。
3. 结果
倒置相差显微镜下观察显示培养3天的细胞呈透亮的圆形，单个或成团，呈棱状或多角形(图1(A))；培养11天，细胞生长覆盖六孔板面积的85%以上，呈现VEC典型的“鹅卵石”样特征(图1(B))。
3.1. RAECs免疫组化鉴定
应用抗VIII因子相关抗原抗体进行免疫组织化学检查，结果显示DAB染色阳性，200和400倍显微镜下观察到细胞浆内有棕黄色颗粒(图2)。
3.2. RAECs免疫荧光鉴定
用抗VIII因子相关抗原抗体进行免疫荧光染色，400倍荧光显微镜下观察细胞质呈现绿色荧光阳性反应(图3)。
Figure 1. (A) Rat aortic endothelia cells (RAECs) after 3 days culture, which appear to be like triangle or polygon (×100); (B) RAECs after 11 days culture, showing a slabstone-like changes (×100). Bar = 25 μm (A, B)
图1. 倒置相差显微镜下的培养3天(A)和11天(B)的大鼠主动脉血管内皮细胞形态学特征(×100)
Figure 2. Immunohistochemical staining with monoclonal anti-Factor-VIII antigen antibody in culturing RAECs (A: ×200, B: ×400). Bar = 50 μm (A,B)
图2. RAECs中内皮细胞标志分子VIII因子相关抗原表达阳性(A: ×200, B: ×400)
Figure 3. Immunofluorescence staining with monoclonal anti-Factor-VIII antigen antibody in culturing RAECs (×400)
图3. RAECs中VIII因子相关抗原免疫荧光染色阳性(×400)
3.3. RAECs活力检测
在传代培养过程中，内皮细胞经台盼蓝试验，检测活细胞率 > 95%。
4. 讨论
VEC最初仅被看作血管内壁的屏障，后来研究显示VEC具有重要的内分泌功能，可调节血管壁的通透性、维持血流状态及出血凝血功能平衡、调节血管张力 [1] 。应用培养的VEC建立相关疾病的离体模型，在心血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等领域研究中较为普遍 [3] 。大鼠因其繁殖较快、取材方便且价格低廉，故此分离培养大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)常被用于以上的相关研究。有关RAECs的培养方法改进的研究层出不穷。
血管内皮细胞位于血管内膜表面，其下面是结缔组织层，主要由Ⅲ型胶原构成，其体外培养多采用消化法、植块法，消化法结合反复机械刮取法及热处理植环法，但存在着原代培养难度大、效率低，以及在细胞分离培养过程中操作较繁琐并容易增加微生物和非血管内皮细胞污染等缺点 [4] [5] [6] [7] 。大鼠胸主动脉管腔细小，肋间动脉分支多，使大鼠胸主动脉血管内皮细胞的原代培养比较困难。机械刮去发和植块法获取大鼠血管内皮细胞的方法易混杂其他血管壁细胞，近几年来已逐渐被酶消化法取代。一般的胶原酶消化法培养内皮细胞产量低，操作较复杂且消化时间不好掌握，而多步骤酶消化法常因成纤维细胞或平滑肌细胞污染导致培养失败 [8] 。本实验采用将主动脉内膜外翻，利用缝合线结扎、镊子烫烙血管两端的双重封闭，以胰蛋白酶直接消化的方法，获取一定数量的内皮细胞，传代培养时利用RAECs对胰酶较成纤维细胞及平滑肌细胞敏感的特点，采用低浓度、短时间差速消化传代法，提高了RAECs的纯度。通过多次实验对比还发现，以0.125%及0.25%浓度的胰蛋白酶分别消化18~20 min及10~12 min获取的RAECs数量及纯度无明显差别。
内皮细胞呈单层“铺路石”状排列是其生长特性，也是其形态学的重要特征，而第VIII因子是内皮细胞的标志性特征 [5] [7] 。在本实验中，我们通过形态学观察发现其生长出的细胞呈单层“铺路石”状生长(见图1)，采用免疫组织化学与免疫荧光两种检验方法证明有第VIII因子相关抗原存在，确认为血管内皮细胞，增加了鉴定的可靠性(见图2)。
这些结果显示以胰蛋白酶直接消化法获取RAECs，以差速消化传代进一步提高内皮细胞纯度的方法操作简单，经济实用，可以进一步推广应用。同时应用此低浓度胰蛋白酶直接消化法获取高产量RAECs时，应注意以下操作要点：①针头穿过血管腔时应注意勿损伤主动脉内膜，结扎血管两端时要严密，结扎线外的主动脉残端尽可能除去，烫烙主动脉残端要彻底，确保仅主动脉内膜面与胰蛋白酶接触；②选择合适的胰蛋白酶浓度和控制好消化时间是实验的关键，使之既能充分消化主动脉内皮组织，又可减少RAECs损伤和非血管内皮组织细胞混入；③原代培养的RAECs对营养要求较高，须用含20%胎牛血清的培养液培养，传代细胞可用含10%~15%胎牛血清的培养液培养；④原代培养应用六孔板种板，利于细胞间相互影响，通过产生促生长活性物质，互相促进生长。
本方法能够获得高产率的RAECs，重现性较好，操作相对简单，并且所得到的细胞纯度和活力都相对较高，为体外VEC离体模型的建立以及对心血管疾病、肿瘤血管生成和血管修复等发生机制的研究提供了技术支持和理论指导。
基金项目
国家自然科学基金项目(No. 81660751, 81660151, 81260504,)；江西省重点研发计划项目(No. 20161 BBG70067)，江西省自然科学基金项目(No. 20171BAB205085)。