5-氟尿嘧啶/壳聚糖载药微球的制备及性能研究

Preparation and Properties 5-Fluorouracil-Loaded Chitosan Microsphere

摘要: 选择高分子材料壳聚糖为药物载体，戊二醛为交联剂，司班-80和硬脂酸镁为复合乳化剂，液体石蜡和真空泵油为混合油相，采用乳液-化学交联法制备了5-氟尿嘧啶/壳聚糖载药微球。考察了载药微球的微观形貌、尺寸和药物包封率等理化性能，并对微球的释药性能进行了研究评价。结果表明微球表面结构规整、均匀，壳聚糖与5-氟尿嘧啶之间存在着比较强的分子间作用力，粒径在400 nm左右，且分散性比较好，药物包封率可达87.6%。在pH = 7.4和pH = 1.2的缓冲溶液中都有较好的缓释效果，但pH值越低条件下的缓释效果越好。5-氟尿嘧啶与壳聚糖的质量投料比越小，微球的释药速率越快。

Abstract: 5-Fluorouracil/chitosan (5-Fu/Cs) microspheres were prepared in emulsion by using glutaralde-hyde as cross-linking agent, span-80 and magnesium stearate mixture as emulsifier, and paraffin oil-vacuum pump oil mixture as oil phase. The morphology, dimension and drug-encapsulation capabilities of 5-Fu/Cs microspheres were explored. The surface of 5-Fu/Cs microspheres is smooth, and the dimension is regular and uniform (~400 nm); strong interaction between the 5-Fu and Cs has been found. The drug encapsulation efficiency was determined (~87.6%). The microspheres showed excellent sustained-release effect in buffer solutions with pH = 7.4 and pH = 1.2, while higher release rate was found in lower pH solution. In addition, the release was also affected by the feed ratio of 5-Fu to Cs. With decreasing weight fraction of 5-Fu, increasing releasing rate was found.

1. 引言

随着人类生活水平逐步提高，生活节奏加快，癌症的发病率与日俱增。5-氟尿嘧啶(5-Fu)是一种广谱抗癌药物，因其治疗效果可靠而被广泛应用于临床，主要用于治疗消化道肿瘤，也常用于治疗肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌等 [1] [2] 。但其毒性较大，代谢过程过快而使其应用受到了一定程度的限制。其对肿瘤细胞的选择性差，在杀伤癌细胞的同时，也对人体产生了严重的毒副作用。尤其在浓度较大的情况下，对正常细胞的毒副作用更加明显 [3] 。它在体内的半衰期短，仅为5~10分钟，临床上为了达到有效的体内血药浓度，往往采用大剂量、持续给药或反复多次给药等均增加了癌症病人的痛苦 [4] 。以新型高分子为载体的缓释给药系统能够实现减少给药次数，在病人体内持续释药，并降解为具有生物相容性的物质的目的。在增加患者顺应性，提高药物的治疗效果，减少用药的总剂量等方面成为一种潜在的解决途径 [5] [6] [7] [8] 。

壳聚糖(Cs)是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物学功能。Cs及其分解产物无毒，具有良好的生物相容性和生物可降解性，可选择性地与肿瘤细胞聚集，抑制肿瘤细胞的生长，并可通过活化免疫系统，显示抗癌活性。Cs作为药物的包覆材料，在缓释给药系统中的应用己引起了人们浓厚的兴趣 [9] [10] [11] [12] [13] 。Ohya [11] 首次用水/油(W/O)型乳化剂，以戊二醛为交联剂，运用乳化交联法制备了氟尿嘧啶壳聚糖微球(平均粒径：0.8 ± 0.1 μm)，该微球可被细胞表面特殊的受体识别，对SK-ep-1肝癌细胞有特殊亲和力和抗癌作用 [12] 。近年来，国内外以高分子材料为载体，以5-Fu为模型药物的微球制备虽然己有报道，但是所得的微球或者粒径普遍比较大，或者药物包封率和药物含量较低，无法兼顾 [3] [14] - [19] 。本文以壳聚糖作为包封材料，抗癌代表性药物5-Fu为模型药物，制备缓释给药5-氟尿嘧啶/壳聚糖载药微球(5-Fu/Cs微球)，进行探讨性的研究，检测微球各项性能指标，包括微观形态、药物包封率、释放性能等，以观察该微球作为药物载体的可行性，为将来的临床应用提供实验依据。

2. 实验部分

2.1. 主要原料及试剂

5-氟尿嘧啶(5-Fu)：天津金耀氨基酸有限公司；壳聚糖(Cs)：分析纯，国药集团化学试剂上海有限公司；Span80、石蜡油：化学纯，广州市思伽化工有限公司；戊二醛(25%水溶液)、醋酸(36%)、氢氧化钠：分析纯，天津市精细化工研究所；无水乙醇、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠：分析纯，北京化学试剂公司；汽油、真空泵油(100＃)：中国石油天然气股份有限公司大连石化分工司。

2.2. 主要仪器

紫外可见分光光度仪：752N，上海瑞科有限公司；气浴恒温震荡器：SHZ-88A，江苏太仓实验设备厂；台式高速冷冻离心机：LGR10-4.2型，北京医用离心机厂；恒速数显电动搅拌器：DSX-90型，杭州仪表电机有限公司；红外光谱仪：V70型，德国Bruker公司；场发射扫描电子显微镜：S-4800型，日本日立公司。

2.3. 制备5-Fu-Cs微球

采用乳液-化学交联法，称取壳聚糖溶于0.2 mol/L的醋酸溶液，配成20 g/L的Cs溶液100 ml，按m(5-Fu)：m(Cs)分别为1:1、1:3、1:5、1:6和1:7称取5-Fu加入到25 g上述Cs溶液中，搅拌溶解，慢慢加入到油相中，油相为200 ml含15 g/L司班-80和5 g/L硬脂酸镁的真空泵油与石蜡油混合物，V (真空泵油):V (石蜡油)为1:1，反应容器为三口圆底烧瓶。搅拌至乳液状反应0.5 h缓慢加入戊二醛溶液15 ml。升温至40℃反应2 h，用氢氧化钠溶液(25 wt%)调节pH = 7，再反应1 h后离心分离，产物先用汽油洗涤，然后用无水乙醇洗涤，在50℃条件下真空干燥得到粉末状产品。

2.4. 测试与表征

标准曲线的绘制：取125 mg 5-Fu分别用0.1 mol/L稀HCl溶液、pH = 7.4的缓冲溶液，及pH = 1.2的缓冲溶液，定容至50 ml (2.5 mg/mL)，分别取稀释后的溶液2 ml、3 ml、4 ml、5 ml、6 ml再分别定容至50 ml，配制成0.1~0.3 mg/mL的标准溶液，在260 nm处用紫外-可见分光光度计测试吸光度，拟合曲线得标准曲线方程A₁ = 1.104C₁ − 0.004(R*R = 0.9999) K₁ = 1.8，B₁ = 0.0；A₂ = 1.076C₂ − 0.0084(R*R = 0.9998) K₂ = 1.9，B₂ = 0.0；A₃ = 1.072C₃ + 0.0076(R*R = 0.9997) K₃ = 1.9，B₃ = 0.0。

微球药物含量和包封率的测定：准确称取5-Fu/Cs微球20 mg加到锥形瓶中，用0.1 mol/L HCl溶液50 ml溶解24 h后过滤，滤液移至100 ml容量瓶中定容，测试其吸光度，根据工作曲线来求其浓度，按下列公式计算药物含量和包封率 [10] ：

微球缓释性能分析：称取5-Fu/Cs微球50 mg放入透析袋中并封口，分别置于盛有pH = 1.2缓冲溶液和pH = 7.4缓冲溶液的250 ml磨口锥形瓶中，37℃条件下以100 r/min的速率恒温震荡，定时取5 ml释放介质测定其紫外吸光度，同时补充等量释放液，根据工作曲线计算其浓度，并绘制累计释药率-时间曲线。

红外光谱表征：采用溴化钾压片法，扫描范围500~4000 cm⁻¹。

微观形态表征：样品喷金后在场发射扫描电子显微镜下观察并拍照。

3. 结果与讨论

3.1. 红外光谱分析

图1为原料(5-Fu)与产品(Cs微球和5-Fu-Cs微球)的红外光谱图。5-Fu谱图中1682.1 cm⁻¹归属于5-Fu

Figure 1. IR spectra of raw material and product

图1. 原料及产品的红外光谱图

的特征吸收峰(C=O和C=C伸缩振动吸收峰)，1488.2 cm⁻¹归属于-CF=CH-中的C-H的面内弯曲振动吸收峰，1238.6 cm⁻¹归属于C-N伸缩振动吸收峰，868.3 cm⁻¹归属于-CF=CH-中的C-H的面外弯曲振动吸收峰，818.4 cm⁻¹和775.6 cm⁻¹归属于-CF=CH-中的C-H的面外变形振动吸收峰。Cs微球谱图中在1663.5 cm⁻¹处出现Cs微球的特征吸收峰，归属于C=O的伸缩振动，1425.2 cm⁻¹处是-CH₂-的弯曲振动吸收峰，1084.3 cm⁻¹和1062.7 cm⁻¹归属于C_S吡喃环中C-H的弯曲振动吸收峰。5-Fu/Cs微球谱图中在1278.2 cm⁻¹处是5-Fu中的C-N伸缩振动红移吸收峰，900.1 cm⁻¹处出现了5-Fu中的-CF=CH-中的C-H的面外弯曲振动红移吸收峰，吸收峰洪移表明Cs包裹5-Fu后，5-Fu分子之间的作用力被Cs削弱。818.4 cm⁻¹和775.6 cm⁻¹处归属于-CF=CH-中的C-H的面外变形振动吸收峰。在1663.5 cm⁻¹处Cs的吸收峰消失，而在1641.3 cm⁻¹处出现了特征吸收峰，1084.3 cm⁻¹处吸收峰向低波数1062.7 cm⁻¹漂移且变弱，而1030.0 cm⁻¹的吸收峰大大减弱，这些情况说明5-Fu与Cs产生了较强的分子间相互作用力。

3.2. 微球微观形态分析

图2为5-Fu/Cs微球的SEM图。由图可见5-Fu/Cs微球的外观形态规整，无塌陷，为球形，且为单分散性，粒径均匀，微球彼此未发生黏连，粒径在400 nm左右。

3.3. 药物包封率

5-Fu/Cs微球的药物包封率与投料比之间的关系见表1，药物包封率在45.2%~87.6%。由于乳化阶段形成粒径小且分布均匀的微球，此时粒径与搅拌器转速有关，交联剂使微球固化，将模型药固定在壳聚糖骨架中。其次5-Fu在水中的溶解度比较大且呈弱酸性，该工艺与传统方法相比成球固化时间缩短，通过控制体系的PH值及投料比，使药物包封率提高。

3.4. 微球释药性分析

图3为5-Fu和5-Fu/Cs微球在pH = 1.2缓冲溶液中药物释放曲线，5-Fu在1.5 h基本上就释放完全了，而5-Fu/Cs微球在前3h内释放的快，当药物释放率达到50%左右释放逐渐减缓，40 h时释放率达到62%，未释放的还有38%左右，这说明5-Fu/Cs微球的控释性能很好。由于醛氨缩合反应形成键桥使微球固化，将药固定在壳聚糖骨架中，从而达到缓释效果。

Table 1. The relationship between embedding rate of chitosan microspheres and raw material rate

表1. 微球药物包封率与投料比关系

Figure 2. SEM image of 5-Fu/Cs microspheres

图2. 5-Fu/Cs微球的SEM图

Figure 3. Drug-releasing curves of sample in solution (pH = 1.2)

图3. 在pH = 1.2缓冲溶液中的释放曲线

3.5. 投料质量比对释药性的影响

图4为5-Fu/Cs微球在pH = 1.2缓冲溶液中的释放曲线，m(5-Fu):m(Cs)为1:5的微球在5 h释药已达56%而m(5-Fu):m(Cs)为1:3的微球释药到65%，这是因为C_S较多形成的囊壁较厚，所以随着m(5-Fu):mCs)比的减小，微球的缓释效果增强。

3.6. 溶液pH值对微球释药性的影响

图5中在初期(前2 h)微球的释药性基本不受溶液pH值的影响；但2 h后，在pH = 7.4条件下微球的释药速度要比pH = 1.2条件下快，尤其是20 h之后更加明显。两种不同pH值条件下前5 h释药速度快，10 h后趋于平缓，24 h后载药微球在pH = 1.2缓冲溶液中释放率为57%，在pH = 7.4缓冲溶液中释放71%，可见微球的体外释药性与溶液pH值有关，酸性条件下缓释效果更好。

Figure 4. Drug-releasing curves of 5-Fu/Cs microspheres in solution (pH = 1.2)

图4. 5-Fu/Cs微球在pH = 1.2缓冲溶液中的释放曲线

Figure 5. Drug-releasing curves of 5-Fu/Cs microspheres in different solution

图5. 5-Fu/Cs微球在不同pH值缓冲溶液中的释放曲线

4. 结论

以壳聚糖为药物载体，戊二醛为交联剂，真空泵油和石蜡油为混合油相，司班-80和硬脂酸镁为复合乳化剂是一种行之有效的制备5-氟尿嘧啶/壳聚糖载药微球的方法。所得5-Fu/Cs微球的外观形态规整，无塌陷，且为单分散性，粒径均匀，微球彼此未发生黏连。粒径约400 nm，药物包封率在45.2%~87.6%。体外释药性分析表明5-Fu/Cs微球具有良好的缓释性能，随着m(5-Fu):m(Cs)比值的减小，微球的缓释效果增强，酸性环境下缓释效果更好，优越于碱性环境。

基金项目

嘉兴学院SRT资助项目(SRT2016C148)，嘉兴学院实验室开放基金(201601)，浙江省“十二五”省级实验教学示范中心重点建设项目。