氟、砷联合对人成骨细胞活性及形态的交互作用

The Interaction between Fluoride and Arsenic on the Activity and Morphology of Human Osteoblast

摘要: 目的：观察氟、砷联合作用对体外培养人成骨细胞活性的影响，从而探讨氟、砷对骨的作用，砷是否对氟骨病有一定的影响。方法：体外培养人成骨细胞，氟对人成骨细胞的作用终浓度分别为10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0 mg/L，砷对人成骨细胞的作用终浓度分别为1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0 mg/L，相互交叉作用于人成骨细胞，观察细胞形态变化。结果：砷浓度为1 mg/L与各浓度氟联合作用时，各组细胞全部死亡。砷浓度为0.1 mg/L与各浓度氟联合作用于人成骨细胞，可见部分细胞死亡，细胞形态较完整，可见细胞核，周围少量细胞碎片。砷浓度为0.01 mg/L、砷浓度为0 mg/L与氟浓度为10 mg/L联合作用于人成骨细胞时，显微镜内可见少量细胞死亡及少许细胞碎片。其余联合实验组镜下可见较多人成骨细胞，轮廓清晰，细胞核完整，未见明显细胞碎片。结论：氟砷联合作用时，对人成骨细胞毒性一定程度的增加。

Abstract: Objective: By observing the effect of fluorine and arsenic’s combination on activity of human os-teoblast in vitro, we defined the role they played in bone, and whether they influence bone meta-bolism or not. Method: Culture human osteoblast in vitro. When the concentration of fluorine reached 10 mg/L, 1 mg/L, 0.1 mg/L and 0 mg/L respectively, the concentration of arsenic reached 1 mg/L, 0.1 mg/L, 0.01 mg/L and 0 mg/L, they mutually interact on human osteoblasts, and then we observe the change of cell morphology. Result: When arsenic concentration of 1 mg/L related with various concentration of fluorine mutual acted, all cells died; when arsenic concentration of 0.1 mg/L part of cells died, at the same time cell morphology was complete, the nucleus was visible, and there were some cell debris around. When arsenic concentration of 0.01 mg/L, 0 mg/L mutually acted with fluorine concentration of 10mg/L in human osteoblast, a few of cells died and a cellular debris can be seen in the microscope. For the osteoblast of other joint groups, the nucleus is complete without obvious cells fragments, and all cells outline is clear. Conclusion: The joint action of fluorine and arsenic could arouse a certain degree of increase in toxicity of osteoblast.

1. 引言

地方性氟中毒可损伤全身各个系统及器官。慢性氟中毒引起的以骨骼损害尤为严重，称之为氟骨症。近年来，有研究发现氟中毒病区大都存在氟砷联合中毒，其患者出现氟骨症、骨质疏松加重现象 [1] [2] 。因此，同时考虑氟和砷对骨骼的影响，以及砷在氟骨症中的作用，对于阐明氟骨症、骨质疏松等骨骼疾病非常重要。本研究通过细胞实验对成骨细胞在氟砷联合中毒的作用机制做初步探讨。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2.1.1. 细胞株

SV40转染人成骨细胞hFOB1.19 (中国医学科学院上海细胞库)。

2.1.2. 药品和主要试剂

氟化钠(NaF，天津科密欧化学试剂有限公司)；亚砷酸钠(NaAsO₂，国药化学试剂有限公司)；碳酸氢钠(NaHCO₃，上海虹光化工厂)；甲醇(上海振兴化工一厂)；DMEM/F12培养基、胎牛血清(Gibco公司，USA)；G418、青链霉素混合液、姬姆萨染液、谷氨酰胺、胰蛋白酶、二甲基亚砜、四甲基噻唑兰(北京索莱宝科技有限公司)。

2.1.3. 器材

RT-6000酶标分析仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；TS-8型转移振荡器(其林贝尔仪器制造有限公司)；SW-CJ-IFD型洁净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；TG-16W台式高速离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)；8MCO-15AC二氧化碳培养箱(日本SANYO公司)；TE2000-U倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；AB104-N型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器)。

2.2. 实验方法

2.2.1. SV40转染人成骨细胞的培养

SV40转染人成骨细胞hFOB1.19用含10%胎牛血清和青、链霉素100 U/mL的D-MEM/F-12培养基中，置33.5℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。

2.2.2. 人成骨细胞96孔板模型的建立

调整hFOB1.19细胞浓度为1.0 × 10⁵个/mL，96孔培养板上每孔接种1.0 × 10⁴个细胞，置33.5℃、5% CO₂的饱和湿度培养箱培养24小时。用D-MEM/F-12完全培养基调整氟浓度为20 mg/L、2 mg/L、0.2 mg/L，调整砷浓度分别为2 mg/L、0.2 mg/L、0.02 mg/L。

弃去96孔板中培养基，分别以各浓度氟、砷离子工作液各100 μL交叉加入细胞孔内，每联合组各加3个副孔。加氟或砷后，各孔内氟对人成骨细胞的作用终浓度分别为10 mg/L、1 mg/L、0.1 mg/L、0 mg/L，砷对人成骨细胞的作用终浓度分别为1 mg/L、0.1 mg/L、0.01 mg/L、0 mg/L，相互交叉作用。详见表1。

分别在作用24 h、48 h、72 h后每孔加入MTT工作液各10 μl (5 mg/mL)，继续培养4 h后，弃去各孔内上清，加入DMSO 200 μL/孔后在振荡器上震荡10 min，酶标仪上测OD值，并计算细胞抑制率(%)。实验重复3次。

$细胞抑制率=\frac{对照孔平均OD-实验孔平均OD}{对照孔平均OD}\times 100\%$

2.2.3. 氟、砷联合对人成骨细胞细胞形态的影响

弃去上清，灭菌PBS清洗2遍后，每孔加入200 μl的PBS浸润细胞，置显微镜下观察细胞形态并拍照。弃去PBS后加入甲醇10 uL/孔，静置1~2 min后甲醇自然挥发后加入配置好的姬姆萨工作液200 uL/孔，静置染色12 min后弃去染液，用双蒸水反复清洗4~5次，置显微镜下观察细胞形态并拍照。

2.2.4. 统计方法

采用SPSS 16.0建立数据库，定量实验数据均以( $\bar{x}\pm s$ )表示，进行方差分析和t检验。

3. 结果

3.1. 氟、砷及其联合作用对人成骨细胞活性的影响

氟、砷及其联合作用于人成骨细胞24 h后，仅砷1 mg/L氟10 mg/L联合作用孔OD相对于对照孔明显下降，其他剂量的氟、砷单独或联合在作用24 h后对细胞没有明显的杀伤作用。

氟、砷及其联合作用于人成骨细胞48 h后，砷1 mg/L及其联合氟10、1、0.1 mg/L时，OD值明显低于对照孔，其他剂量的氟、砷单独或联合在作用48 h后对细胞没有明显的杀伤作用。

氟、砷及其联合作用于人成骨细胞72 h后，砷1 mg/L及其联合氟10、1、0.1 mg/L时，OD值明显低于对照孔，同时砷1 mg/L氟10 mg/L组的OD也明显低于对照孔。结果见表2和表3。

Table 1. Groups of fluorine and arsenic on HOB

表1. 氟、砷联合对人成骨细胞作用的分组

Table 2. The OD value of HOB on fluorine and arsenic ( x ¯ ± s )

表2. 氟、砷联合对人成骨细胞作用的OD值( $\bar{x}\pm s$ )

注：与0浓度氟0浓度砷组相比，^*P < 0.05，^**P < 0.01；与同浓度氟0浓度砷组相比，^#P < 0.05，^##P < 0.01；与0浓度砷同浓度氟组相比，^△P < 0.05，^△△P < 0.01。

Table 3. The inhibitory effect of fluorine and arsenic on HOB

表3. 氟、砷联合作用对人成骨细胞的抑制率

3.2. 氟、砷及其联合作用对人成骨细胞形态的影响

氟砷交叉联合作用于人成骨细胞48 h后，使用姬姆萨染液进行细胞染色。分别使用显微镜进行10倍、40倍放大显示后拍照。图中见，高砷(砷1 mg/L)与各浓度氟联合作用时，各组均未见完整细胞，见少许细胞碎片。中砷(砷0.1 mg/L)与各浓度氟联合作用于人成骨细胞，可见少量散在完整细胞，细胞核完整，周围少量细胞碎片。低砷(砷0.01 mg/L)、无砷与高氟(氟10 mg/L)联合作用于人成骨细胞时，显微镜内可见少量散在细胞及少许细胞碎片。余联合实验组镜下可见较多人成骨细胞，轮廓清晰，细胞核完整，未见明显细胞碎片。结果见图1和图2。

4. 讨论

大量研究证实，适量的氟促进成骨细胞分化，过量氟却可引起骨骼损害 [3] [4] 。而尚未有文献报道砷对骨的直接损害，仅动物实验发现五价砷可蓄积在骨骼中。但是，氟砷联合中毒病区，往往存在氟骨症加重现象 [5] 。有学者报道氟砷暴露水平与Runt相关转录因子2 (Runx2)、尿I型胶原交联氨基末端肽(UNTX)等多种骨代谢指标存在交互作用 [6] [7] 。然而，氟砷联合中毒在人群调查、动物实验及细胞实验中结论不完全一致，砷如何会影响氟骨症尚不十分清楚，氟、砷的相互作用十分复杂，又缺乏统一的标准。本研究试图寻找氟、砷联合作用导致成骨细胞损害的作用浓度和时间，探索砷影响氟骨病发生、发展的有力依据。

本研究结果表明，随着氟砷联合作用于人成骨细胞的时间延长，对细胞杀伤作用增强。作用24 h后，高氟高砷组有统计学变化；作用48 h后，中氟高砷组、低氟高砷组有统计学变化；作用72 h后，高氟中砷组有统计学变化。

注：1(高氟)、2(中氟)、3(低氟)、4(无氟)；A(高砷)、B(中砷)、C(低砷)、D(无砷)。

Figure 1. The morphology effect on HOB of fluorine and arsenic for 48 h (×10)

图1. 氟砷联合作用48 h对人成骨细胞形态的影响(×10)

注：1(高氟)、2(中氟)、3(低氟)、4(无氟)；A(高砷)、B(中砷)、C(低砷)、D(无砷)。

Figure 2. The morphology effect on HOB of fluorine and arsenic for 48 h (×40)

图2. 氟砷联合作用48 h对人成骨细胞形态的影响(×40)

本研究的细胞染色图片显示，在氟单独作用下，细胞质和细胞核没有因氟的作用而破坏；在砷单独作用下，细胞核和细胞质的完整性随着砷的浓度增加逐渐降低。中浓度的砷与各浓度氟联合作用下，高氟中砷、中氟中砷对细胞质和细胞核均有一定破坏，而中砷联合低氟和无氟均未出现明显联合作用。

在一定范围内，随着氟浓度的增加，人成骨细胞活性呈现先抑制后无效，再到抑制的过程。低氟与高氟明显抑制人成骨细胞活性。砷在一定范围内具有成骨细胞毒性。高砷(≥1 mg/L)对人成骨细胞的作用是致死性的，随着砷浓度减低，其毒性迅速下降，当接近0.1 mg/L时，无明显细胞毒性。氟砷联合作用十分复杂，短期氟砷联合对人成骨细胞作用不明显；中期时砷对人成骨细胞的毒性明显，适量氟(1 mg/L)对砷的毒性作用有明显的抑制作用；而长期高氟与中砷可形成毒性的叠加。低氟与中砷又无明显叠加效果。目前对氟、砷对骨影响的研究只是冰山一角，我们需要更多研究来进一步了解氟砷联合作用对骨的毒性。

基金项目

贵州省科技厅社发攻关项目(NO：黔科合SY字[2012]3125号)；贵州省卫生厅基金项目(NO: gzwkj 2012-1-023)。