1. 引言
Rab3亚家族(subfamily)有Rab3B、Rab3C和Rab3D。其中Rab3A由220个氨基酸构成，是一种重要的功能性蛋白质 [1] 。Rab3A广泛分布在各类神经细胞中，在大脑中的丰度最高，通过胞吞和胞吐的方式一起调控神经递质的释放和记忆力的表达。随着年龄的增加，人类和灵长类动物都会出现记忆力的衰退，最受关注的是衰老认知功能的改变和学习记忆能力的衰退。部分老人会出现阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD) [2] 。当细胞带有Rab3A基因时，细胞中的脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor, BDNF)会使相邻神经元的电讯息交流量增加200%~300%，胞吞胞吐频率加快，缺乏Rab3A基因的细胞，则没有增加。BDNF是一种在脑内合成的蛋白质，它主要分布于机体中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对大脑神经元的生长发育、存活分化等起着重要的作用 [3] 。
由此可见，Rab3A对于灵长类动物的认知功能、记忆能力的表达和神经元的存活、发育和分化都起着十分重要的作用。通过从NCBI数据库下载原始数据，进行序列比对，构建系统发育树，由于伦理问题，以往对于Rab3A的研究都是以小鼠作为研究对象，通过此系统发育分析研究，希望为以后的研究做基础。
2. 材料和方法
2.1. 数据来源
在NCBI数据库中下载人，黑猩猩，大猩猩等12种哺乳动物的核苷酸序列，序列格式为Fasta格式。并且下载各个物种的基因组位置信息文件进行编辑。本研究涉及到的物种如表1。
2.2. 数据处理
用Perl语言编写程序代码，对12个物种的Rab3A基因注释文件进行处理，确定每个基因在染色体上的位置，对每个物种的CDS序列重命名，使每个基因序列的名字与基因ID一致，以便后续的分析工作。
2.3. 方法
利用Blast+软件比对得到12种动物的同源性，再利用多重序列比对软件clustalw比对核苷酸序列,利用共线性分析工具MCscanX、Colinearscan得到基因的共线性信息，从而得到染色体中共线性片段(block)，最后分析确定基因组间的同源共线性信息，在Linux系统下编辑Perl语言脚本用dotplot绘图算
Table 1. Species used in this study
表1. 本研究所用物种
Figure 1. Collinearity plot between dotplot of human and chimpanzee, gorilla
图1. 人和黑猩猩、人和大猩猩的dotplot共线性图
法，绘制出12种动物之间的共线性关系图，基于MEGA7.0软件包中Maximum Likelihood法，Neighbor-joining法分别构建进化树，得到相同的系统发育树，进而进行分析。
3. 结果分析
3.1. 序列比对分析
对12个哺乳类动物的Rab3A基因核苷酸序列进行比对，通过比对发现有一半的物种的Rab3A记忆基因存在于第19条染色体上。由此可见，这个基因属于一个相对古老的基因。利用Perl语言编写dotplot绘图算法，绘制出各个物种之间的点阵图，其中人和黑猩猩、大猩猩的同源共线性dotplot点阵图(如图1)基本趋向于共线性。其他几种哺乳动物也具有类似的点阵共线性(如图2)，但共线性表现在少数染色体之间。
3.2. 系统进化树分析
从NCBI数据库下载12种物种的原始数据：人、大猩猩、黑猩猩、小家鼠等等。利用同源性、共线性比对筛选出记忆基因Rab3A的核苷酸序列，找出其在物种中的位置。
Figure 3. Phylogenetic tree of 12 mammalian species
图3. 12种哺乳动物的系统进化树
用Clustalw软件对记忆基因Rab3A的核苷酸序列进行比对，利用MEGA7.0软件包中Maximum Likelihood法，Neighbor-joining法，分别构建进化树，对比两种进化树，发现两种进化树具有高度的一致性，如图3所示。使用Tamura-Nei距离模型 [1] 的最大似然方法可以推断出演化历史，利用邻位联接和BioNJ算法，选择具有较高对数似然值(−1428.44)的拓扑结构，构建出以Rab3A为条件的系统进化树。由记忆基因(Rab3A)构建的进化树可以看出，进化树主要分为两大分支，一只为人、黑猩猩、大猩猩、猕猴、狗、绒猴、白颊长臂猿、苏门答腊猩猩、东非狒狒、野猪，其中人和黑猩猩、大猩猩、白颊长臂猿、猕猴、东非狒狒、绒猴、苏门答腊猩猩8个物种之间亲缘关系比较近，其中人和黑猩猩之间亲缘关系最为相近；另一支为小家鼠和褐家鼠2种物种，他们之间的亲缘关系最为相近。对比物种进化树可见，基于记忆基因(Rab3A)构建的系统发育树能够很好的反应各个物种之间的亲缘关系。
4. 讨论
对获得的记忆基因Rab3A的核苷酸序列进行系列的同源共线性分析比对发现，哺乳动物的Rab3A核苷酸序列存在一定的同源性，根据研究显示，Rab3A是调控突触之间胞吞胞吐快慢的重要Ca2+感受器 [4] ，有研究表明Rab3A是神经生长抑制因子(GIF)发挥活性的必需蛋白质，而GIF的含量过低会使神经细胞的树突和轴突的生长过高，导致神经元细胞死亡，而GIF与阿尔兹海默症有着密切联系 [5] ，所以Rab3A与阿尔兹海默症的发病有一定联系。所以，分析Rab3A基因的系统发育树和进化过程对探索学习记忆能力的减退以及阿尔兹海默症的治疗具有重要意义。系统发育树的分析结果可以表明各个哺乳动物在进化过程和分类地位上的关系，本研究得到的以Rab3A基因为基础的基因系统进化树与已有的物种进化树具有较高的相似性，可表明本研究数据和结果的准确性和可靠性。由于伦理限制问题，以往关于记忆基因的研究都是以小鼠作为对象来研究，本研究通过系统发育树将小鼠和人以及各种哺乳动物的关系联系在一起，以希望为以后突破伦理限制的研究做出贡献。
综上所述，该研究对多种哺乳动物的记忆基因(Rab3A)进行了多重序列比对、同源共线性分析和系统发育分析，针对记忆基因的同源共性进行了准确的分析，希望以此作为基础，让更多学者进一步探究记忆基因在神经元之间的生长发育作用、学习认知能力的表达机制以及与阿尔兹海默症的发病的联系。
基金项目
国家大学生创新项目基金支持。
参考文献