猪流行性腹泻病毒的结构和非结构蛋白应对宿主细胞先天性免疫

Structural and Non-Structural Proteins of Porcine Epidemic Diarrhea Virus against Congenital Immunity of Host Cells

摘要: 猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种肠道致病菌。它引起仔猪流行性腹泻，这是许多国家在畜牧业中出现重大经济损失的最重要原因之一。在某种程度上，Toll样受体(TLRs)的转录和干扰素(IFN)的激活这两种先天免疫反应对抗病毒免疫有一定的影响。后者在抵御病毒感染的防御中发挥了关键作用。PEDV可以有效通过屏障感染宿主。宿主细胞有一系列复杂的策略来抵抗病毒。目前已经发现，在一些研究中，PEDV调控的宿主先天固有免疫出现了很大的提升。为了逃避宿主–先天免疫反应，PEDV采取了两种方法，PEDV将病毒蛋白编码为干扰素拮抗剂，其病原体相关的分子模式(PAMPs)被隐藏。PEDV的非结构蛋白和一些蛋白酶对这一过程有一定的影响。本文介绍了当前对宿主细胞抗PEDV的先天免疫反应，这过程涉及了PEDV的结构性和非结构性的主要蛋白质，并且分析了几个PEDV入侵细胞的关键机制，进一步为探索PEDV传染性免疫和致病机制提供重要的理论依据，并为临床疫苗或药物研究提供主要的实践支撑。

Abstract: Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is a central intestinal pathogen, causing porcine epidemic diarrhea in piglets, which is one of the most vital reasons why plenty of countries have been caught sight of substantial economic losses in animal husbandry. About innate immune response, to some extent, Toll-like receptors (TLRs), transcription and activation of interferon (IFN) resulted in a few influences on anti-virus immune. The latter was served as a critical role in the defensive shields against the viral infection. The host could be efficaciously infected by PEDV through the obstacle. There are series of sophisticated strategies to resist virus for host cells. Currently it has been spotted that excellent improvement took place in some studies about the host innate in munity regulated by PEDV. To escape from host-innate immune response PEDV adopts two approaches, originally PEDV encodes viral proteins as interferon antagonists, and its pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) would be hided then remain undercover. Non-structural proteins and some proteases of PEDV have been posed some impact on the process. This review illustrates the current grasp on innate immune response of host cells to anti-PEDV covering major proteins between the structural and the non-structural of PEDV to analyze several critical mechanisms on cellular entry of porcine epidemic diarrhea virus, further providing important theoretical grounds for exploring infectious immunity and pathogenic mechanisms of PEDV and supplying the main practical support for its clinical vaccines or medicine research.

1. 引言

PEDV是可以感染猪的小肠上皮细胞的一种I型冠状病毒 [1] 。它与传染性胃肠炎(TGE)有相似的临床症状，PEDV导致腹泻，从而造成哺乳仔猪的高死亡率，这种损害没有发生在4~5周龄的小猪，这可能是主要用来区分PED和TGE的特征 [2] 。另外，野猪也会被PEDV感染，急性水性腹泻、脱水和呕吐认为是该病的主要特征。就经济方面而言，PED已经在不同的国家造成了巨大的损失。在20世纪70年代早期的比利时和英国，第一个被证实发生在猪场的PEDV是从饲养猪和肥猪的身上检测出，在大约7年后，PEDV被检测为该病的主要病因 [3] 。从那时起，在1982年，在中国和韩国的一些亚洲国家发现了PEDV，导致了乳猪的高死亡率，席卷了亚洲大部分地区，并导致了2010年以来亚洲养猪业巨大的经济损失 [4] [5] [6] 。后来，美国也被发现有PEDV [7] 。

先天免疫系统一直被认为是保护宿主免受病毒入侵的第一道防线 [8] 。在这些影响因素中，I型干扰素(IFN-α/β)的转录和激活的在某种程度上对病毒有抵御作用。早期的报告显示，PEDV通过其结构蛋白、非结构蛋白和蛋白酶的功能来降低IFN的抗病毒活性，抑制机体通过IFN产生的防御机制。PEDV感染vero细胞和肺泡巨噬细胞，发现机体生产的IFN-α/β明显降低 [9] [10] 。此外，通过转染病毒的dsRNA，发现PEDV降低IFN-α/β活性 [11] 。PEDV的一些关键蛋白参与一系列复杂的抗病毒策略，这些蛋白不仅包括结构蛋白(N蛋白)，还包括非结构蛋白(nsp1，nsp5和PLP2)。在这一过程中，人类冠状病毒(SARS-CoV和NL63-CoV)的核衣壳(N)蛋白类蛋白酶可以作为宿主对抗病毒感染的IFN拮抗剂，来减少由真核细胞I型干扰素合成和分泌。在这些过程中，病毒蛋白水解和去泛素化活动对干扰抗RNA病毒复制的IFN效应产生重要的影响。

2. 先天免疫

通常情况下，在各种冠状病毒的感染过程中，一些具有特定功能的蛋白质编码，逐渐形成一套反应机制来阻碍和逃逸宿主先天免疫，并将抗病毒药物分解，这个对PEDV也不例外。多种防御机制将在机体受到病毒感染后，抵御外来病原体入侵或监测和清除体内异常细胞，保护宿主免受其侵袭的防御机制可被称为先天免疫系统。病原体相关分子模式(PAMPs)可以被细胞表达的模式识别受体(PRRs)来感知，包含一些在病原微生物入侵或复制的过程中的保守分子。毫无疑问，在诱导抗病毒免疫反应的特异性和效率方面，产生中和抗体和激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或自然杀伤细胞是必要的，但其他宿主细胞仍可提供免疫机制，以防止病毒感染。本文简要介绍了在宿主固有免疫过程中，Toll样受体在抗病毒免疫或者干扰转录激活的作用。

2.1. 在抗病毒免疫中的Toll样受体(TLRs)

TLRs是一种I型跨膜蛋白家族，它可以识别不同的PAMPs。TLR3识别的PEDV dsRNA也被认为是一种PAMPs。在病毒入侵后，细胞外的亮氨酸重复区识别并结合产生的PAMPs。而细胞质区域负责招募含有TIR域的连接分子蛋白，从而刺激下游的信号级联反应 [12] 。TLR识别PAMPs后，TLR的细胞质区域中结合下游连接分子来联合刺激一系列的信号转导分子，激活转录因子如NF-κB AP-1 IRF-3，这些因子可以调节促炎细胞因子和趋化因子的产生，抑制病原体入侵。

在细胞中广泛分布的TLRs能够识别细菌性病原体–介导的先天免疫反应，并在宿主受到病毒刺激后对其免疫应答反应。TLR2可以鉴定广泛的PAMPs，包含细菌、真菌、寄生虫和病毒衍生物，TLR4是鉴定细菌脂多糖的关键受体 [13] 。检测到不同类型的病毒RNA后(见图1)，核内体TLRs (TLR3、TLR7、TLR8和TLR9)可以被激活，这些TLRs的表达将促进I型IFNs和其他抗病毒细胞因子的产生。TLR3分布更为广泛，但主要表达在传统的DCs细胞 [14] [18] 。在dsRNA非应答细胞系的293细胞中，使人类的TLR3过表达能增强dsRNA-调节的NF-κB激活。相关研究表明，小鼠的TLR7可能识别另一种复合物 [15] ，名叫洛索立宾(免疫兴奋剂)。它在抗病毒和抗肿瘤活性方面起着重要作用 [16] [17] 。TLR7和TLR8能够识别病毒鸟嘌呤或鸟苷酸丰富的ssRNA，如人体免疫缺陷病毒(HIV)、水疱性口炎病毒(VSV)和流感病毒(IV) [15] [18] [19] 。通过对染色质结构的鉴定，发现在几种自身免疫性疾病的发病机制中，TLR9起着一定的作用。

2.2. 干扰素的转录和激活

病原微生物感染宿主，其PAMP在宿主体内受到广泛分布的PRRs监视，PRRs被激活并募集下游相关蛋白，从而触发一系列磷酸化或泛素化调节信号级联，最后核因子κB (NF-κB)和干扰素调节因子(IRFs)诱导干扰素(IFN)和促炎细胞因子的表达 [12] 。

IFN和IFN诱导的细胞抗病毒反应是避免病毒感染的首要防御机制。IFN是一种低相对分子质量的细胞因子，具有广泛的生物学活性，如广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等功能。猪干扰素可分为I型和II型。IFN-α IFN-β是I型干扰素，它们有很好的抑制病毒复制和抗肿瘤的效果。II型干扰素只有IFN-γ，主要参与免疫调节和炎症反应。

PEDV在复制过程中可以编码一系列的蛋白质抑制I型IFN的转录和激活，有一些发挥拮抗剂作用。在病毒显阴性的情况下，IFN产生后，所有的有核细胞的刺激I型IFN的产生，但II型IFN只能由少数的细胞分泌，如自然杀伤细胞、活化的T淋巴细胞和巨噬细胞 [20] 。

在感染期间，在宿主模式识别受体识别病原体分子后，IFN-α/β转录水平的调控。首先，在细胞内的核内体中，病毒的dsRNA，ssRNA，CpG DNA可以单独激活TLR3，TLR7/8和TLR9，导致受体的二聚化，干扰素调节因子IRF3/IRF7的激活，该过程通过TRIF的组装MyD88的募集和AP-1的激活的信号级联启动后，NF-κB发挥作用。RIG-I和MDA5的RIG-I-like解旋酶可以识别病毒RNA启动IFN-β刺激器1(IPS-1)调整不同监管因素或激酶。通过半胱天冬酶的活化和RIG-I和MDA5的募集区域，以促进IRF3/7和NF-κB通路的激活，诱导IFN-α和IFN-β伴随cAMP-反应元素结合蛋白(CBP)的转录，从而产生I型干扰素。随后，只要IFN-α和IFN-β快速分泌到细胞外，干扰素受体(IFNR)以自分泌和旁分泌的方式识别IFN-α/β，引起JAK/STAT通路的激活。伴随着受体相关的JAK1的磷酸化，SH2区域磷酸化可以募集STAT1和STAT2。灰色圆圈表示泛素化，黄色的圆圈表示磷酸化。

Figure 1. Signal pathways for IFN-I production and relative gene expressions [25]

图1. IFN-I产生的信号通路和相关基因表达 [25]

IFN能唤醒NK细胞和树突状细胞启动适应性免疫系统。干扰素和细胞因子的表达将收到相关干扰素和细胞因子的调节，并由生殖细胞系基因编码的模式识别受体(PRRs)激活。PRRs识别病原体的PAMPs，将信息传递到下游信号分子中，大部分的RNA病毒能被PRRs感知比如细胞内TLR3、TLR7和RIG-I或MDA5，最后诱导I型IFN的生成。dsRNA病毒复制的产物可以被TLR3和RIG-I识别的，然后信号应该通过在不同的适配器蛋白质的运动，传递给下游TANK-结合激酶1 (TBK1)和抑制性κB激酶ε (IKKε) [21] [22] [23] 。激活的TBK1/IKKε导致IRF-3的活化和磷酸化。核易位将发生在磷酸化的IRF-3并和DNA元素结合，激活转录干扰素α和干扰素β [21] [24] 。IRF-3和IRF-7在IFNα/β的诱导和产生扮演重要的角色。

病毒复制过程中，产生的dsRNA是一种PAMP可以触发PRRs并诱导IFNα/β的表达。Toll样受体和RIG-I受体这两个PRRs主要负责识别在宿主中的病毒的dsRNA，IFN-β的表达是分别由TLR3/TRIF通路和RIG-I/MDA5/IPS-1通路调节。TLR3/TRIF是识别细胞内的dsRNA的主要途径，但RIG-I/MDA5/IPS-1总是可以在细胞质中激活。IFN在生产后并没有直接发挥抗病毒作用，但它结合自身或相邻细胞膜上的特异性受体，然后通过下游的JAK/STAT途径引起许多效应分子的表达，如IFN诱导基因(ISGs)和转录因子的表达，最终完成抗病毒作用。因此，该生物活性并不存在于干扰素本身。

干扰素α/β结合受体使磷酸化Jak和Tyk2激酶。JAK和Tyk2是STAT1和STAT2的激活子。STAT1和STAT2磷酸化后形成IRF9的相关二聚体，从而产生干扰素刺激基因3 (ISGF3)复合物。只要ISGF3复合物进入细胞核，磷酸化的STAT1和STAT2就会伴随着脱磷酸化后回到细胞质中。主要研究了各种类型的ISGs，比如MxA、OAS-1/RNase L、RIG-I/MDA5、ISG15和PKR，它们均为抗病毒效应分子。

3. PEDV在I型干扰免疫反应的逃逸

虽然干扰素系统具有巨大的抗病毒活性，但PEDV的感染也不能完全控制。在宿主抗病毒先天免疫反应，I型干扰素(IFNα/β)是最快速有效的抗病毒反应。相对而言，PEDV在某种程度上对I型干扰素具有一定的抵抗力。在进化过程中，包括PEDV在内的许多病毒都形成了一种精细对抗干扰素信号通路的策略，使其在宿主细胞中感染和扩散 [26] 。另外，PEDV表达的不同的蛋白质采取不同的方法对抗，或隐藏其PAMPs-dsRNA以达到逃逸I型干扰素介导的抗病毒免疫应答。

3.1. PEDV N protien抗宿主先天性免疫

冠状病毒的核衣壳(N)蛋白是病毒感染细胞中最丰富的蛋白质。先前的研究已经发现，PEDV感染抑制I型IFN的合成。病毒的木瓜样蛋白酶2认为是IFN拮抗剂。但 [27] 发现仙台病毒诱导的IFN-β的产生、干扰素调节因子3 (IRF3)的激活，和NF-κB这三者会受到PEDV N蛋白抑制。

有四种IKKs在宿主防御系统的调节中扮演重要的角色，其中包括经典IKKs(IKKα和IKKβ)和IKK-related激酶(IKKε和TBK1) [28] 。在RNA病毒感染的信号通路和诱导IFN产生的过程中，TBK1中起着不可替代的作用，它调节IFN和细胞因子的抗感染机制。TBK1 (TANK-结合激酶)是与IKK相关的激酶之一，其对于IRF3/7的磷酸化和活化非常重要。IRF3/7的磷酸化和活化与蛋白二聚、核易位、DNA结合以及IFN-I应对病毒感染的诱导等生物活动相关联 [22] [29] [30] [31] [32] 。TBK1稳定性的抑制或破坏有利于抑制TLR、RLR等相关通路的信号传递。进一步的研究表明，PEDV N蛋白与靶向TBK1直接相互作用，这种相互作用会分解TBK1和IRF3的关联性，同时抑制IRF3的激活和I型IFN的产生 [27] 。结果表明，TBK1可能是核衣壳蛋白作用的靶向信号分子之一。并且相关研究表明TBK1能够与PEDV N蛋白结合并使其磷酸化，从而对PEDV的致病性产生影响，该相关问题值得进一步研究。

3.2. PEDV nsp1和nsp5抗先天免疫应答

作为IFN的拮抗剂，大多数病毒的3C或3C样蛋白酶可以裂解I型IFN的信号分子来抑制自然免疫反应，例如，NEMO是NF-κB基本调节元件，作为一个关键的集中调节元件可以从线粒体抗病毒蛋白的募集接收信号，比如RLRs(视黄酸诱导基因I样受体)。NEMO对IKK化合物基础调节，它是NF-κB干扰素的合成过程中最重要的关键调节元件之一，也是NF-kB的激活所必需。PEDV Nsp5的半胱氨酸蛋白酶活性促进了NEMO的蛋白水解，它是一种IFN拮抗剂，它在谷氨酰胺231 (Q231) [33] 中编码3C样蛋白酶，并对病毒与宿主间的相互作用产生重大影响，这是PEDV感染机制的决定性因素。

PEDV另一个非结构蛋白nsp1也是相关病毒的IFN拮抗剂，用于检测如何抑制依赖蛋白酶体通路的I型干扰素反应并抑制宿主干扰素基因合成 [34] [35] ，尤其在PEDV感染细胞后，一旦包括结构和非结构蛋白在内的整个病毒基因序列克隆和表达后，IFN-β的生成总是成为抑制的主要目标对象。除了IFN-β的抑制作用，在其他PEDV非结构蛋白(nsp3, nsp7, nsp14~16)中，nsp1也发现对IRF3启动子活性的抑制作用。它可以通过CREB结合蛋白(CBP)的降低，打断IRF3和CREB (cAMP-反应性元件结合)结合蛋白之间的连接结构，但不能阻挡IRF3磷酸化或核易位，一旦TBK1激活，磷酸化IRF3进行二聚化之后，IRF3磷酸化或核易位发生在隐蔽核定位信号过程中。该过程在PEDV致病性上发挥着重要的作用。

3.3. PEDV的dsRNA和PLP2隐藏以逃避先天的免疫反应

PAMPs和PLP2成为PEDV避免先天抗病毒免疫应答的最重要的方法。有一些来自病原体的表面的稳定分子结构，它们在进化中高度保守，并且在大量相关的微生物中是相同的，但没有人类，如病毒的dsRNA和细菌脂多糖。PRRs视为免疫系统细胞表达的免疫受体，识别为PAMPs，它的RLR受体与病毒的识别有密不可分的关系。RIG-I、MDA5和LGP2是RLR受体的三种类型。RIG-I和MDA5可以识别病毒的dsRNA，察觉不同的病毒入侵。随后当面对病毒感染时，在细胞内出现了一些dsRNA诱导产生抗病毒IFN-I。作为在细胞质RNA解旋酶的一类，RIG-I受体结合PAMPs来识别包含5'-三磷酸盐的dsRNA病毒，但不是来自它自身 [36] ，长dsRNA也可以特异性结合MDA5 [37] 。通过这些相互作用感染的细胞能触发RLRs下游信号分子的激活，从而显著促进IFN-I和相关的炎症因子的产生，从而产生抗病毒的免疫反应。5'-cap结构可以增加mRNA的稳定性和真核mRNA的翻译效率，该结构形成与相关酶的修饰后的转录过程中。RLR不能识别cap结构，因为它不能在RNA 5'端甲基化。对于冠状病毒的RNA修饰，2'-O-甲基化和N7-甲基化成为在许多与mRNA相关的过程中最重要的部分，这似乎有助于自身和非自身病毒RNA的差异来应对先天抗病毒免疫，病毒甲基化他们mRNA的5'cap结构 [38] [39] [40] [41] 。例如，缺乏2'-O-MTase活性可能对IFN-I敏感，从而导致其表达的增加。另外，2'-O-甲基转移酶和N7-甲基化分别由nsp16和nsp14编码，使甲基化的cap结构安置在病毒mRNA达到RNA隐藏以避免RLR识别。

蛋白酶认为是在所有病毒复制周期中病毒RNA合成最重要的蛋白。除蛋白酶活性外，相关蛋白分子的泛素化和无泛素化修饰功能在调节先天免疫信号通路的免疫反应中起着极其重要的作用。PEDV编码的PLP2作为I型IFN的拮抗剂，因为它的去泛素化DUB活性和干扰素拮抗活性，有助于抑制IFN-I的表达，以逃避先天免疫。根据初步研究，人类NL63 CoV (HCoV-NL63) [42] 的类木瓜蛋白酶(PLP)也具有DUB活性，可以降低IFN活性 [43] 。人类冠状病毒SARS-CoV发现产生大约6个先天免疫的拮抗物，特别是在SARS-CoV [44] 中存在的PLP区域(非结构蛋白3) nsp3。作为一种多功能蛋白质，PEDV编码的PLP2是一个新的冠状病毒DUB，其活性的关键位点是PLP2的催化活性位点。但PEDV PLP2能识别RIG-I和STING，将泛素化结合的两种蛋白质分离起来这就是PEDV PLP2如何抑制IFN的反应。

4. 结论

一个国家的国民经济发展覆盖农业、商业、工业等各个领域，促进各个地区的协调发展对国家建设是至关重要的。然而，农业经济结合畜牧业发展是非常关键的，具有相对较高的地位和作用。大多数肠道冠状病毒包括PEDV，可导致流行性腹泻病的传播，导致猪群的局部感染甚至大规模爆发，给养猪业带来巨大的经济损失，因此畜牧业的发展必然受到威胁。先天免疫防御的损伤有助于PEDV感染宿主，然而病毒侵入机体，先天免疫细胞会立即启动病毒识别和抗病毒的反应，产生具有抗病毒功能的分子，Toll样受体(TLRs)和IFN发挥主导作用。在一系列防御功能被破坏的过程中，PEDV的一些结构和非结构蛋白在一定程度上对其产生了一定的作用。

本文介绍一些重要蛋白的生物功能，来解释他们如何躲避特异的抗病毒细胞因子(干扰素α/β)和I型跨膜蛋白(Toll样受体)的防御功能，从而顺利入侵宿主。虽然TBK1与IRF3组合很微弱，但是结构蛋白N蛋白可以通过结合TBK1来抑制IRF3磷酸化，导致失去来自TLR和RLR的信号，降低IRF3的激活和干扰素(α/β)和ISG3的表达以减弱抗病毒效果。PEDV nsp5蛋白质为IFN拮抗剂，它可以编码3C蛋白酶水解NEMO，并作为必要的信号分子在干扰素反应抑制NF-κB的功能。nsp3蛋白在抗病毒过程中不仅可以削弱IFN-β的产生，还可以减弱IRF3和CREB (而不是IRF3磷酸化)之间的结合。由于其具有独创性的结构功能，PEDV PLP2的DUB功能和拮抗IFN激活的特性有利于抵抗先天性免疫。此外，对PEDV mRNA的未甲基化5'-cap-结构不能被RLRs发现，以逃避固有免疫反应。深入了解PEDV如何逃逸宿主的防御策略，有利于揭示PEDV的发病机制，发现抗病毒药物的新靶点，从而为PEDV的防控奠定基础。

NOTES

^*袁芃和杨舟同为第一作者。

^#通讯作者。