生物转化法制备手性醇(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇

Preparation of Chiral Alcohol (R-[3,5-Bis(Trifluoromethyl)Phenyl] Ethanol by Biocatalytic

摘要: 手性醇是一类重要的手性模块化合物，广泛应用于医药、化工和农业等领域。(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是合成用于治疗癌症病人化疗时引起恶心和呕吐的NK-1受体拮抗剂(如阿瑞吡坦和福沙吡坦)的重要手性中间体。不对称生物还原[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙酮是制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的重要方法。本文从土壤中筛选获得一株对[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙酮具有高效还原的微生物菌株HNNQ1，该菌株被鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp)，命名为寡养单胞菌HNNQ1。对菌株HNNQ1不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的条件进行了研究，结果表明，菌株HNNQ1的最佳还原条件如下：辅助底物种类为异丙醇，且浓度为15% (v/v)，反应温度为30℃，反应缓冲液pH为7.2，最适的底物浓度为40 mmol/L，菌体浓度为250 g/L，反应时间为15 h。在上述条件下，产物的产率和对映体过量值(enantiomeric excess, ee)分别为98.8%和99.6%。

Abstract: Chiral alcohols are a group of the most important building blocks, and have been widely used in the pharmaceutical, chemical and agriculture industries for production of chiral information into the products. (R)-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] ethanol is an important chiral intermediate for the synthesis of a tachykinin NK1 receptor antagonist widely administered to cancer patients without the nausea and vomiting side effects that often happen with chemotherapy, such as Aprepitant (Emend) and Fosaprepitant (Ivemend). The biocatalytic asymmetric reduction of 3,5-bis(trifluoromethyl) acetophenone is an effective approach for the preparation of (R)-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] ethanol. In this paper, a novel strain HNNQ1, which had highly efficient reduction for 3,5-bis(trifluoromethyl) acetophenone, was isolated from a soil sample and identified as Stenotrophomonas sp. The reaction conditions for prepared (R)-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] ethanol by whole cells of strain HNNQ1 was carried out. The obtained optimized conditions for the bio-reduction are as follows: 2-propanol with a concentration of 15% (v/v) as co-substrate, buffer pH 7.2, 40 mM of 3,5-bis(trifluoromethyl) acetophenone, 250 g/L of resting cells as biocatalyst, reaction for 15 h at 30˚C and 150 rpm. Under above conditions, best yields of 98.8% and 99.6% of product ee were obtained, respectively.

1. 引言

手性醇是在手性碳原子上连有活泼羟基的一类模块化合物，因其具有特殊的生理活性以及独特的光、热和化学稳定性，广泛应用于化学、医药工业、精细化工和农业等领域 [1] [2] [3] ，特别是在制药工业中，手性醇作为一类手性化合物的构建模块，已经成为多种类型手性药物合成的重要中间体或手性原料。例如D-(-)-泛酰内酯可以合成D-泛酸钙(Vitamin B₅) [4] ，(S)-(4-氯苯基) (吡啶-2-基)甲醇可以合成抗过敏药物倍他司汀(Betahistine) [5] ，(S)-(-)-3-氯-1-苯基-1-丙醇可以合成抗抑郁药氟西汀(Fluoxetine) [6] ，(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯可以合成降压药卡托普利(Enalapril)、贝那普利(Benazepril)和赖诺普利(Lisinopril) [7] 。

手性芳香醇(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇是用于合成新型化疗止吐药物NK-1受体拮抗剂类药物的重要手性中间体，由其制备得到的抗抑郁药物在治疗一系列中枢和末梢神经系统抑制中具有很好的潜在疗效。目前，制备光学纯(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法主要有化学法和生物法。采用化学法合成时，需要使用昂贵的过渡金属Ru等化学催化剂，且步骤繁琐，反应条件苛刻，能耗高，污染大，产率偏低 [8] [9] [10] [11] 。生物法则是利用游离酶或全细胞来催化制备，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强等特点。本文以微生物全细胞催化[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙酮不对称还原制备NK-1受体拮抗剂类药物阿瑞吡坦的重要手性中间体(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇为研究模型(见图1)，从自然环境中筛选获得新型、高效的生物催化剂，并对其进行分析和鉴定，此外，对其生物催化过程进行优化。以期筛选获得能高效不对称还原[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的微生物菌株，实现NK-1受体拮抗剂类药物重要手性中间体(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的生物法高效制备。同时，本文的研究也将为生物催化制备其他手性药物提供很好的借鉴，研究结果可丰富微生物来源还原酶库，为生物催化制备功能手性化合物提供新酶源和新途径。

2. 材料与方法

2.1. 菌种

寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp) HNNQ1，由本实验从土壤中筛选得到。

2.2. 试剂

[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮，消旋体[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇和(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇购自北京金奥利维科技发展有限公司。其他试剂为国产生化试剂或分析纯。

2.3. 培养基

筛选平板培养基：[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮50 mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，NaCl 1 g/L，MgSO₄∙7H₂O 0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。

斜面培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏4 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L， KH₂PO₄ 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄∙7H₂O 0.5 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。

种子和发酵培养基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏4 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄∙7H₂O 0.5 g/L，pH自然。

2.4. 试验方法

2.4.1. 菌种筛选

10 mL的生理盐水中加入1 g土样并摇匀，吸取0.2 ml悬浊液加入到富集培养基中，30℃，150 r/min，培养7 d；然后吸取富集培养液1 ml到新鲜的富集培养基中，30℃，150 r/min，培养7 d；将第二次富集培养液分别稀释100~10,000倍，各吸取0.1 ml涂布在筛选平板培养基上，30℃恒温培养3 d，对平板培养基长出的菌株进行转化能力考察，选取优良菌株。

筛选流程：富集培养→平板初筛→菌种复筛→种子培养→发酵培养→生物转化→气相色谱检测产物→获得优良菌株。

2.4.2. 菌种鉴定

利用电子显微镜观察菌的细胞形态，并由上海生工测序16SrDNA，将所得基因序列对比分析GenBank保藏的基因序列，构建系统发育树，以确定该菌的种属。

Figure 1. Preparation of (R)-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] ethanol by biocatalytic

图1. 生物催化法制备(R)-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇

2.4.3. 菌体培养

斜面培养：从原斜面上用接种环挑取1环菌种到试管斜面上，30℃恒温培养2~3 d，4℃冰箱保存。

种子培养：从培养成熟的斜面挑取1环菌体接入种子培养基中，500 mL锥形瓶装液量200 mL，30℃振荡培养，摇床转速150 rpm，培养24 h。

发酵培养：将培养好的种子液以8% (v/v)接种量转接至装有200 mL发酵培养基的500 mL锥形瓶中，30℃振荡培养，摇床转速150 rpm，培养48 h。

2.4.4. 菌种收集

湿菌体收集：培养结束后，将发酵培养液于8000 rpm，4℃离心10 min，弃去上清液，收集菌体并用生理盐水洗涤两次，离心10 min，收集洗涤后的湿菌体，备用。

2.4.5. 不对称还原反应

取一定量离心得到的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲液(0.2 mol/L, pH 8.0)中，加入一定浓度的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和一定体积的异丙醇，置于30℃，150 r/min的摇床中恒温反应24 h。反应结束后，反应液用乙酸乙酯萃取，8000 rpm，4℃离心5 min，取1 mL上清液加入少量无水MgSO₄干燥过夜，采用气相色谱分析检测。

2.4.6. 气相色谱分析

不对称还原反应结束后，反应萃取液中的产物和残留底物的浓度采用气相色谱分析，用内标法定量。内标物是十二烷。取1 mL萃取液加入2 μL十二烷进行分析。

气相色谱条件：日本岛津GC-2014气相色谱仪；美国瓦里安CP-Chirasil-Dex手性毛细管气相色谱柱(25 m × 0.25 mm × 0.25 μm)。载气为高纯氮气，流量为2 mL/min；进样量1 μL，分流比为15:1；检测器和进样口温度均为250℃；色谱柱温度80~180℃；升温速度：8℃/min；检测器为FID。各物质的出峰时间约为：[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮3.657 min，十二烷7.365 min，(S)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇8.398 min，(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇8.798 min。

根据峰面积和测出的相对校正因子，可分别计算出反应液中的底物和产物的浓度。

$\begin{array}{l}C产物=f^{\prime }产物\times \frac{\text{S}产物\times \text{C}十二烷}{\text{S}十二烷}\\ C底物=f^{\prime }底物\times \frac{\text{S}底物\times \text{C}十二烷}{\text{S}十二烷}\end{array}$

从而求出反应的产率Y，计算式为：Y/% = C_产物/C₀ × 100%。式中C₀、C_产物分别为反应起始底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。

产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess, ee)来表征。定义式为：

$ee=\frac{CR-CS}{CR+CS}\times 100\%$

式中C_R和C_S分别为R型和S型[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的摩尔浓度。

3. 结果与讨论

3.1. 菌种筛选与鉴定

通过初筛和复筛，从土样中筛选得到一株产羰基还原酶菌株HNNQ1，能高选择性催化合成(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。经分子生物学分析，该菌16SrDNA (1462 bp)与嗜麦芽寡养单胞菌PBCC9 (Stenotrophomonas maltophilia strain PBCC9，GenBank登录号为No. HM775375.1)的相似度为99%，因此，菌株HNNQ1鉴定为寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)，命名为Stenotrophomonas sp. HNNQ1。

3.2. 不对称还原反应条件研究

3.2.1. 添加不同种类的辅助底物对产率和ee值的影响

本文研究了半乳糖、麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、异丙醇、乙醇、甲醇等不同种类的辅助底物对产率和ee值的影响，结果见图2。由图2可知，添加这些辅助底物有助于提高催化[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的产率和ee值，且以异丙醇为辅助底物的产率和ee值最高，分别为84.6%和96.1%。

3.2.2. 辅助底物异丙醇浓度对产率和ee值的影响

本文研究了0、5、10、15、20、25、30、35和40% (v/v)等浓度的异丙醇对产率和ee值的影响，结果见图3。

由图3可知，在一定浓度范围内随着异丙醇的浓度的增加，产率也增加，当异丙醇浓度为15%时，

1.空白对照，2.半乳糖，3.麦芽糖，4.葡萄糖，5.乳糖，6.蔗糖，7.甘油，8.异丙醇，9.乙醇，10.甲醇

Figure 2. Effects of co-substrate type on yield and ee values

图2. 不同辅助底物种类对产率和ee值的影响

Figure 3. Effects of 2-propanol concentration on yield and ee values

图3. 异丙醇浓度对产率和ee值的影响

产率达到最大，为96.9%，然后当异丙醇浓度继续增大时，产率反而降低。此外，结果研究表明，异丙醇的添加可以提高产物的ee值，且ee值随异丙醇浓度的增加变化不大，都在97%以上。综上所述，反应体系中异丙醇添加的最佳浓度为15%，此浓度下，产物的产率和ee值分别为96.9%和99.5%。

3.2.3. 反应温度对产率和ee值的影响

本文研究了不同的反应温度(20、25、30、35和40℃)对产率和ee值的影响，结果见图4。由图4可知，催化[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的最佳反应温度为30℃。

3.2.4. 缓冲液pH值对产率和ee值的影响

本文研究了缓冲溶液不同pH值对产率和ee值的影响，结果见图5。由图5可知，催化[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的最佳缓冲液pH值为7.2，此时产物的产率和ee值分别为99.2%和99.7%。

Figure 4. Effect of reaction temperature on yield and ee value

图4. 反应温度对产率和ee值的影响

Na₂HPO₄-柠檬酸：4.2、5.0、5.6、6.0，Na₂HPO₄-NaH₂PO₄：6.0、6.5、6.8、7.2、7.5、8.0，tris-HCl：8.0和8.5

Figure 5. Effect of buffer pH on yield andeevalue

图5. 缓冲液pH值对产率和ee值的影响

3.2.5. 底物浓度对产率和ee值的影响

本文研究了反应体系中添加不同浓度的底物(10、20、40、60、80和100 mmol/L)对产率和ee值的影响，结果见图6。由图6可知，最佳的底物添加浓度为40 mmol/L，此时产物的产率和ee值分别为95.6%和99.7%。

3.2.6. 菌体浓度对产率和ee值的影响

取不同浓度的湿菌体(100、150、200、250、300和350 g/L)悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入40 mmol/L的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮和15% (体积比)的异丙醇，置于30℃，150 r/min的摇床中恒温反应6 h。反应结束后，气相色谱分析产物的产率和ee值，结果见图7。由图7可知，最佳的菌体添加量为250 g/L，此时产物的产率和ee值分别为50.8%和99.7%。

3.2.7. 不对称还原反应的过程曲线

本文研究了在最佳反应条件下(5 mL 0.2 mol/L pH 7.2的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液体系，250 g/L静息细胞，40 mmol/L [3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮，1 mL异丙醇，30℃，150 rpm)，菌株HNNQ1不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的反应过程，结果见图8。

由图8可知，随着反应时间的延长，产率逐渐增大，ee值几乎保持不变。当反应时间达到15 h后，产物产率几乎保持不变(此时产率和ee值分别为98.8%和99.6%)，反应基本完成。因此，确定反应转化所需时间为15 h。

Figure 6. Effect of 3,5-bis(trifluoromethyl) acetophenone concentration on yield and ee value

图6. [3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮底物浓度对产率和ee值的影响

Figure 7.Effect of cell concentration on yield and ee value

图7. 菌体浓度对产率和ee值的影响

Figure 8. Process curve of prepared (R)-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] ethanol by the asymmetric reduction

图8. 不对称还原制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的过程曲线

4. 结论

从土样中筛选得到一株产羰基还原酶的菌株，经鉴定为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp) HNNQ1，该菌能高选择性催化制备(R)-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。利用单因素实验，确定菌株HNNQ1不对称还原[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙酮的最佳条件：最佳辅助底物为异丙醇，最佳添加浓度为15% (体积比)，反应温度为30℃，反应缓冲液pH为7.2，底物浓度为40 mmol/L，菌体浓度为250 g/L，反应时间为15 h。在上述条件下，产物的产率和ee值分别为98.8%和99.6%。

基金项目

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(143252)资助，湖南科技大学科学研究基金项目(E51530)。

NOTES

^*通讯作者。