摘要: 本研究对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养，根据形态学特征、培养特性及rDNA-ITS序列分析相结合的方法对分离到的菌种进行鉴定，并对其与黄瓜枯萎病原菌尖孢镰刀菌
Fusarium oxysporum同时接种进行抑菌试验，以筛选抑制尖孢镰刀菌
Fusarium oxysporum的内生菌菌株。结果表明，从紫斑牡丹中获得20株内生真菌，经形态和分子共鉴定出11种，J2为菊拟茎点霉菌
Paraphoma chrysanthemicola (Hollós) Gruyter，J6HUI为
Aspergillus calidoustus Varga，J7HEI为马铃薯刺盘孢
Colletotrichum coccodes (Wallr.) S. Hughes，J8为木贼镰刀菌
Fusarium equiseti (Corda) Sacc；G9无性型为多喙茎点霉
Phoma multirostrata (P.N. Mathur, S.K. Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema，有性型为Boeremia sp.；G1、G6为番茄棘壳孢
Pyrenochaeta lycopersici R.W. Schneid. & Gerlach，J1为
Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm，G5为
Fusarium sp.，J6HUI2为
Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai；J7HUI为
Peyronellaea sp. (派伦霉属)，J1和J6HUI为中国新记录种，其中4株具有抑菌作用，G5、G9、J1和J2对黄瓜枯萎病具有不同程度的抑制作用，平均抑菌率分别为57%、57.2%、28.8%和54.8%。
Abstract:
In this study, the endophytic fungi of root, stem, leaves from Paeonia rockii were isolated and cul-tured. According to the morphological and cultural characteristics and other biological characte-ristics, the isolates were identified by rDNA-ITS sequence analysis. The antibacterial test was per-formed on the isolates and Fusarium oxysporum by the plate-to-lime method to screen endophytic fungi with antibacterial activity. The results showed that 20 endophytic fungi were obtained from Paeonia rockii and 11 species were identified by rDNA-ITS sequence analysis. J2 was Paraphoma chrysanthemicola (Hollós) Gruyter (epigamous), Boeremia sp. (phorozoon); J6H was Aspergillus calidoustus Varga, and J7HEI was Colletotrichum coccodes (Wallr. S. Hughes); J8 is Gibberella intri-cans Wollenw (epigamous), Fusarium sp. (phorozoon); G9 is Phoma multirostrata (PN Mathur, SK Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema (phorozoon) Boeremia sp. (epigamous); G1 and G6 are Py-renochaeta lycopersici RW Schneid. & Gerlach, J1 is Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm, G5 is Gibberella sp. (epigamous), and J6HUI2 is Didymella glomerata (Corda) Qian Chen & L. Cai; J7HUI is Peyronellaea sp. J1 and J6HUI are new to China, of which G5, G9, J1 and J2 can inhibit Fusarium oxysporum in different degrees, the average inhibition rates being 57%, 57.2%, 28.8% and 54.8%, respectively.
1. 引言
植物内生真菌是指在健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙中度过全部或近乎全部生活周期而不使寄主表现任何症状的一类真菌 [1] ，主要为子囊菌及其无性型，少数担子菌和接合菌。内生真菌感染植物组织，菌丝存在于细胞内和细胞间，从寄主中吸收营养物质，如光合产物和矿物质供其生长所需，同时内生真菌为寄主生长发育提供水分、矿质元素等，二者互利互惠 [2] 。植物内生真菌普遍存在于植物组织中，其代谢物不仅能刺激植物生长发育、增强寄主的抗逆性，如抗旱、抗寒等能力 [3] ，而且能提高植物对病虫害的抵抗力 [4] - [9] ，研究发现植物内生真菌能产生具有多种生物活性的新型化合物，如抗菌素、植物生长调节剂、免疫抑制活性物质、抗肿瘤活性物质等，极有可能成为发现和生产生物活性物质的重要来源，在医药、农林业等领域具有潜在的应用前景。
紫斑牡丹(Paeonia rocki)是芍药科芍药属植物，因其花大色艳，植株高大，香味浓郁，在世界上享有崇高声誉，是中国特有植物，极富观赏价值。许多研究者对牡丹内生真菌做了研究，发现从牡丹分离到的多种内生真菌具有抑菌活性 [10] [11] [12] [13] [14] ，然而国内关于紫斑牡丹内生真菌的报道极少，且尚未见抗逆性菌株筛选相关研究，本研究采用组织分离法对紫斑牡丹的根、茎、叶内生真菌进行分离培养并做抑菌实验，以期寻找具有抑菌作用的菌株。
2. 材料和方法
2.1. 供试材料来源
供试标本实验材料为采集于农场、学校等地的牡丹植株，新鲜健康植株的各部分组织，如根、茎、叶，当天进行处理分离培养。
2.2. 内生真菌的分离和纯化
选取健康的牡丹植株，截取根、茎、叶3个部位，用自来水冲洗干净，晾干表面的水分，0.1%升汞漂洗1 min，然后用冰醋酸冲洗，再用75%酒精，漂洗0.5~1 min，无菌水反复清洗。样品经过处理后，在无菌状态下切成0.2 cm × 0.2 cm片，置于PDA培养基上培养，每个皿放置4个样品。在28℃的条件下培养3~7 d，观察记录皿中材料，取切口处培育出的菌落，挑取切口处，挑菌落边缘的菌丝转接到新的PDA培养基，进行2~3次的纯化筛选到内生真菌，每次将最后一次冲洗完的无菌水涂布在PDA培养基上作为对照组。
2.3. 内生真菌的分子鉴定
2.3.1. 内生真菌基因组提取及PCR扩增及测序鉴定
基因组DNA快速提取法提取培养菌种基因组DNA，用天根PFU PCR mix进行PCR扩增，用引物ITS1F/ITS4R (TCCgTAggTgAACCTgCgg/TCCTCCgCTTATTgATATgC)对G1、J2、J6HUI、J6HUI 2、J7、J7HUI、J8扩增ITS区域；用引物27F/1492R (L) (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG/GGTTACCTTGTTACGA CTT)对J1、G5、G6和G9扩增16S rDNA区，对所得PCR产物进行切胶纯化回收(DNA凝胶纯化试剂盒，AXYGEN)，使用NL4对回收DNA片段进行DNA测序(3730 xl, ABI)。
2.3.2. DNA序列比对分析
将得到的DNA序列在GenBank数据库和UNITE进行Blast检索比对，从结果中挑选出同源性较高的DNA序列，查找相似性最高的菌种，确定分离菌株的分类地位。利用软件MEGA6.01按照最大似然法构建系统进化树，发育树的每个分支的统计学显著性分析重复次数为1000次。
2.4. 对黄瓜枯萎病菌的抑制实验
尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum, FO)在无菌操作台上将黄瓜枯萎菌接种于PDA培养基(d = 10 cm)中心，周围接种相应的内生菌四个接种点，置于20℃~25℃，培养48 h后测量抑菌圈直径，抑菌率 = DCK − DX/DCK × 100，DCK = CK菌落直径，DX = 对峙培养后尖孢镰刀菌的菌落直径。
3. 结果与分析
3.1. 紫斑牡丹内生真菌分离鉴定结果
从紫斑牡丹根、茎中共分离出内生真菌20株，经分子鉴定共鉴定出11种。从表1可以看出，从紫斑牡丹中共分离出11株内生菌分属8个属，从根部分离出的内生菌经鉴定，分属三个属，分别属于镰孢菌属(Fusarium)、棘壳孢属(Pyrenochaeta)和(Boeremia)。从茎部分离出的内生真菌经鉴定，分属7个属，分别属于(Nodulosphaeria)、派伦霉属(Peyronellaea sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、拟茎点霉属(Paraphoma sp.)、镰孢属(Fusarium sp.)和Didymella。G6与G1同属，都为Pyrenochaeta lycopersici (番茄棘壳孢)。其中G9生活史中出现了无性型和有性型，G9无性型为多喙茎点霉多喙茎点霉Phoma multirostrata (P.N. Mathur, S.K. Menon & Thirum.) Dorenb. & Boerema，有性型为Boeremia sp.。J1 (Nodulosphaeria cirsii (P. Karst.) L. Holm)和J6HUI (Aspergillus calidoustus)为中国新记录种。图1、图2为11种菌在PDA培养基上的培养特性。
Table 1. Molecular identification and group composition of endophytic fungi from Paeonia rockii
表1. 紫斑牡丹内生真菌分子鉴定结果及类群组成
A-B. J1：Ophiobolus cirsii；C. Paraphoma chrysanthemicola；D. 派伦霉属Peyronellaea sp.；E. Aspergillus calidoustus；F. 派伦霉属Peyronellaea sp.
Figure 1. Culture character of endophytic fungi from Paeonia rockii on PDA medium I
图1. 紫斑牡丹内生菌PDA培养特性I
A. Colletotrichum coccodes; B. Fusarium sp.; C. Pyrenochaeta lycopersici; D-E. Gibberella tricincta/Fusarium sp.; F. Boeremia sp.
Figure 2. Culture character of endophytic fungi from Paeonia rockii on PDA medium II
图2. 紫斑牡丹内生菌PDA培养基菌落II
Figure 3. Phylogenetic tree of ITS for 11 samples and the similar species from Genbank
图3. 供试样品及来自Genbank的最相似物种的ITS序列构建的系统发育树
3.2. 系统发育树分析结果
根据分子鉴定结果，选取35个近缘种的菌株与分离所得内生真菌菌株构建系统发育树。从图3可见，进化树分成三大支，J7HEI与Colletotrichum coccodes聚在一起，属黑盘孢目Melanconiales；其余聚为一大支；其中J2为Paraphoma chrysanthemicola，J7H为Peyronellaea sp.，G9为Boeremia sp.，J1为Nodulosphaeria cirsii都为球壳目Sphaeropsidole；J6H为Aspergillus calidoustus，J6H(2)为Didymella glomerata，G5为Fusarium sp.，J8为Fusarium equiseti，G1和G6为Pyrenochaeta lycopersici，聚为一大支，都为丝孢目Hyphomycetales。
3.3. 抑菌试验结果
对所有菌株与黄瓜枯萎病进行抑菌实验，结果表明，J2、G9、G5和J1对所测试的黄瓜枯萎病均具有不同程度的抑制作用。
从表2中可以看出菌株J2平均抑菌率达57.2%，菌株G9平均抑菌率达57.0%，G5平均抑菌率54.8%，J1抑菌率最小，平均抑菌率达35.3%。
J1最大抑菌圈直径为33.5 mm，能明显抑制黄瓜枯萎病菌的生长，平均抑菌率28.8%，黄瓜枯萎病菌与J1接触之前，初期菌落直径为10.5 mm，5天后菌落直径为26.3 mm (见图4(A)、图4(B))，与J1菌圈接触后，黄瓜枯萎病菌菌落直径最大为26 mm且不再生长，J1菌落3天后菌落直径为25.8 mm，抑菌率为14.2%，8天后抑菌率达60%，最后10天后将黄瓜枯萎病菌覆盖。
G5、J2和G9最大抑菌圈分别为44 mm、46.7 mm、48.7 mm，抑制作用极强，接菌2天后抑菌率达42.7%、37.6%和33.9%，5天后菌落直径30 mm以上，黄瓜枯萎病菌被抑制，生长缓慢基本停止(见图4(C)~(E))，8天后抑菌率70%以上，黄瓜枯萎病菌被覆盖。
Table 2. Antimicrobial activity of 4 endophytic fungi to Fusarium oxysporum
表2. 紫斑牡丹4株内生真菌对尖孢镰刀菌的抑制实验结果
A. 黄瓜枯萎病菌；B. J1抑菌效果；C. J2抑菌效果；D. G5抑菌效果；E. G9抑菌效果
Figure 4. Antimicrobial ring of 4 endophytic fungi to Fusarium oxysporum
图4. 接菌5天后4株内生真菌对尖孢镰刀菌的抑制圈
4. 讨论
植物内生菌作为植物微生物系统中重要的组成部分，对增强寄主植物对环境适应能力具有重要意义。利用植物内生菌防治作物病害是一个潜力巨大的新型领域。本研究从紫斑牡丹中共分离出11株内生菌。马铃薯刺盘孢Colletotrichum coccodes、贼镰刀菌Fusarium equiseti和Didymella glomerata可能为牡丹病原菌 [15] ，其他均为牡丹内生菌，J1和J6HUI为中国新记录种，其中4株具有抑菌作用。
尖孢镰刀菌可引起F. oxysporum，是一种世界性分布的土传病原真菌，可引起瓜类、茄科、香蕉、棉、豆科及花卉等100多种植物枯萎病，而本研究分离出的菌株G9、J2和G5对该病原菌具有很强的抑菌作用，为开发蔬菜、花卉枯萎病生防菌提供理论依据，本研究对内生真菌仅做了分子鉴定及简单的抑菌实验，而内生菌发酵产物的功能还需进一步研究，为菌物资源的鉴定及安全开发提供依据。
基金项目
赤峰学院创新项目(1601008)；内蒙古高等学校科学研究项目(编号：NJZZ16248)资助。