放疗所致的心肌纤维化与microRNA-21的研究进展

The Progress of Research on Myocardial Fibrosis and microRNA-21 Induced by Radiotherapy

摘要: 心脏全部或部分受到一定剂量射线照射，会导致一系列的心功能的损害如心包疾患、心肌纤维化、冠状动脉病变及心脏传导系统损伤等。心肌纤维化是放射性心脏损伤发生发展的重要病理过程。目前多项研究已证实miR-21可加快纤维化进程且在纤维化的组织中异常表达。本文将对心肌纤维化发生机制、病理生理及miR-21与心肌纤维化关系进行阐述，为临床防治放射性心脏损伤提供一定的理论基础。

Abstract: A certain dose of radiation in all or part of the heart can cause pericardial disease, myocardial fi-brosis, coronary artery disease, and heart conduction system damage. Myocardial fibrosis is an important pathological process in the development of radiation-induced heart disease (RIHD). A number of studies have confirmed that miR-21 can accelerate the progression of fibrosis and ab-normal expression in fibrotic tissues. This article will summarize the mechanism of myocardial fi-brosis, path physiology and the relationship between miR-21 and myocardial fibrosis and provide a theoretical basis for the clinical treatment and prevention of radioactive heart damage.

1. 引言

目前恶性肿瘤治疗的主要手段之一为放疗。随着恶性肿瘤治疗手段改善，肿瘤患者生存时间延长，由放射治疗所带来的放射性心脏损伤、放射性肺损伤等问题日益突出。放射性心脏损伤(radiation-induced heart disease, RIHD)是指心脏全部或部分受到一定剂量的辐射所致的心包疾患、心肌纤维化、冠状动脉病变及心脏传导系统损伤等不良并发症，多发生于纵隔及胸部肿瘤放疗中。且已成为恶性淋巴瘤、乳腺癌及胸部恶性肿瘤患者放疗后重要的非癌性死亡原因之一。放射性心脏损伤通常出现在心脏照射后的数年至数十年 [1] 。研究表明既往接受胸部放疗的患者发生冠心病、心脏瓣膜病、心包疾病及血管疾病的概率明显增大，且通常发生于放疗后10~15年里 [2] 。在对发生纤维化器官的研究中均发现miR-21表达异常。因此表明miR-21与纤维化的形成有联系，目前其发生机制正在研究中。本文将对放疗所致的心肌纤维化及miR-21所致的心脏纤维化之间的潜在作用机制做出综述。

2. 放疗所致的心肌纤维化研究现状与病理机制

放射相关性心肌纤维化通常无症状，但确诊时间较晚至少在放疗10年后。RIHD将导致心肌重构、心功能受损、心包疾患、血管病变等，其病理机制尚不清楚，目前临床上尚未有可以防治放射性心肌纤维化的有效手段 [3] [4] 。在反应的早期主要由放疗产生的活性氧物质导致DNA断裂，从而引起的炎症及炎症级联反应，最后直接损伤血管。急性炎症环境启动纤维化的进程，最终引起放射性心脏晚期表现 [5] 。William Pusey报道了一例在1902年第一次使用放疗(RT)成功治疗霍奇金淋巴瘤(HL) [6] 。从那以后，RT已经发展成为一系列HL治疗方法的一种 [7] 。在接受RT治疗的HL长期幸存者中，心血管疾病(CVD)是最常见的死因之一 [8] 。在一项研究中，超过30 Gy的放疗剂量增加了心血管疾病发生的风险 [9] 。一项基于冠状动脉事件在1958年至2001年期间接受放射疗法治疗浸润性乳腺癌的女性人群的病例对照研究报道，治疗后缺血性心脏病发病率与心脏的平均剂量成正比，相对风险每Gy增加7.4% [10] 。目前研究发现RIHD所致心肌纤维化是一个复杂的涉及多种分子机制、细胞信号通路及多器官组织参与过程，以早期炎症和内皮损伤等因素所致纤维母细胞转化和持续激活为核心。Judge [11] 等发现成纤维细胞遭受电离辐射后由正常完成分化需25~35个细胞分裂周期，缩短为3~4个细胞分裂周期即可完成。这使纤维母细胞分化成熟的时间较正常细胞明显加快。Baluna [12] [13] 等对细胞研究表明，内皮细胞粘附分子和趋化因子的上调是正常和辐射诱导的动脉粥样硬化的第一步，导致单核细胞附着，转移并最终形成泡沫细胞。氧化应激，内皮细胞粘附分子水平升高，血管炎症和细胞衰老都是正常衰老过程的结果 [14] ，但在包括心脏 [15] 在内的受照组织 [16] 在早期即可观察到，表明其增强和加速这些分子进程。在对大鼠照射几分钟后，可使受照射血管内皮细胞损伤，分泌粘附分子及生长因子导致急性炎症反应，激活炎性细胞分泌促纤维化因子 [5] 。组织在接受照射数小时后，促纤维化因子如血小板源性生长因子、TGF-β、碱性成纤维生长因子、胰岛素样生长因子及结缔组织生长因子都被释放出来 [5] 。心脏在接受放射治疗后，主要组织结构改变有：1) 心肌细胞变性、炎症及纤维化。心脏组织接受照射后可能导致激肽–缓激肽系统激活，引起毛细血管通透性增高，炎症细胞聚集，纤维渗出。在对动物心脏进行照射后，研究发现射线可导致其内皮细胞功能障碍、血管通透性增加，心肌间质及血管周围等发生急性炎症表现，组织学可观察到心尖及二尖瓣被大量炎性细胞浸润 [17] [18] 。对大鼠进行心脏照射，可以观察到左室心肌间炎症细胞增多、心内膜下泡沫细胞集聚、纤维蛋白渗出现象 [19] 。2) 毛细血管受损主要表现为内皮细胞受损，导致心肌血供不足，从而引起一系列的心肌疾患。内皮功能障碍，导致血栓抗性丧失和粘附分子和细胞因子表达增加，有助于形成促纤维化和促炎症的环境，这是辐射诱导的组织损伤的常见的途径 [20] [21] 。3) 线粒体功能异常：心脏接受照射后，组织氧代谢异常，线粒体功能改变，导致供能系统异常，从而引起心脏组织坏死、凋亡增加。

3. 放射性心肌纤维化

3.1. 心脏成纤维细胞

成纤维细胞(Cardiac fibroblasts，CF)是疏松结缔组织中最主要的细胞，也是细胞外基质的重要组成成分。目前认为成纤维细胞来源于多条途径并参与心脏纤维化，被认为是心肌重构过程中的重要机制 [22] 。目前主要来源如下：① 心脏原位细胞增殖：CF在心脏细胞各组分中所占比例较高 [23] ；② 骨髓源性：在外界一定刺激因素下，骨髓中的干祖细胞可进入血液循环并向心脏归巢 [24] ；③ 心外膜上皮细胞源性：在某些因素作用下，上皮细胞可逐渐丢失上皮表型，并获得间质细胞表型，这一过程被称为上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT) [25] ；④ 内皮间质转化来源：内皮细胞在一定病理因素的刺激下可转化为间质细胞，称为内皮间质转化(endothelial-mesenchymal transition, EndMT)。成纤维细胞在不同的物理、化学因子、生物因子等刺激下，通过不同途径进行增殖并形成纤维网状结构等修护及填充受损组织及器官。

3.2. 心脏成纤维细胞参与心肌纤维化的机制

心肌纤维化是RIHD的重要病理过程，也是其终末阶段。目前认为纤维化的起始反应是急性炎症，随后导致上调纤维化相关基因表达的细胞信号转导、氧环境改变等是纤维化长期持续的关键因素 [26] 。心脏成纤维细胞在心肌梗死、神经体液因子等刺激下可病理性增生并转化成为肌成纤维细胞 [27] 。肌成纤维细胞在多种炎症因子及细胞因子的介导下，迅速迁移并加快增殖，合成大量细胞外基质，其中最主要的是I型和Ⅲ型胶原蛋白 [28] 。I型胶原占心肌胶原80%，III型胶原占心肌胶原11%，I型及III型胶原比例失调及过度增殖导致胶原过度沉积，从而参与纤维化过程。心肌纤维化是多种细胞因子相互作用结果，目前已证实转化生长因子(transfor-mating growth factors beta1，TGF-β) β、TNF-d、IL-6等因子参与了心肌纤维化的过程 [29] [30] 。其中转化生长因子TGF-β1是目前发现与纤维化较为密切的细胞分子之一，其可促进细胞的增值、分化及胶原的合成，抑制胶原的降解。TGF-β-Smads通路是由：TGF-β超家族、TGF-β 受体及Smads蛋白共同组成。对小鼠成纤维细胞进行体外照射，发现通过活化下游Smad信号通路导致TGF-β1及COL-1基因激活并表达，促进成纤维细胞增殖及纤维化的发生 [31] 。Kania [32] 等通过研究自身免疫性心肌炎小鼠模型，发现应用TGF-β中和抗体可明显减少其向成纤维细胞转化。成纤维细胞还可以生成具有降解细胞外基质的基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIM)。目前MMP亚型中MMPl、MMP3、MMP8、MMPl3、MMP2、MMP9、MMPl2、MMP28和MTl-MMP/MMPl4参与纤维化过程 [33] 。TIMP含4种亚型，其中TIMPl在病理状态的心脏中表达量较高。MMP和TIMP之问的平衡是维持细胞外基质动态平衡的重要因素 [34] 。MMP升高可降解胶原蛋白并被纤维间质取代而加重纤维化形成。TIMP表达下降则加重纤维化形成。研究证实TIMP可抑制慢性心力衰竭小鼠模型中心房纤维化 [35] 。

4. microRNA-21与纤维化的形成

4.1. microRNA-21

MicroRNAs是一种有21~29个核苷酸非编码RNA。MicroRNA是核苷酸组成的短片段RNA，在机体内主要通过抑制mRNA转录或促mRNA降解来行使负向调控基因表达的功能。microRNA-21是microRNAs (miRNAs)家族中的成员之一，普遍存在于脊椎动物中的单基因编码的miRNA。人类miR-21基因定位于13号染色体短臂23区2带(17q23.2)。Mir-21的生成调节主要发生在两个水平。一是转录水平(pri-miRNA的生成)。二是转录后水平调节。

4.2. microRNA-21与纤维化

近来一些研究逐渐认为miR-21参与纤维化的发展过程，其与肝脏，肾脏，心脏，肺和皮肤的纤维化进程呈正相关 [36] [37] [38] [39] 。microRNA-21在心脏组织中的心肌细胞、心脏成维细胞、血管平滑肌细胞及血管内皮细胞中均有表达，并通过多种机制参与了心脏纤维化过程。目前研究发现其可通过多个途径参与纤维化进程。

4.2.1. SPRY1在microRNA-21促纤维化中的作用

Spry蛋白是在果蝇中被发现，是RAS/MAPK信号通路特异性抑制蛋白。SPRY家族包括SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4，它们都有不同的功能，其中SPRY1被发现是microRNA-21直接靶基因并介导其直接参与心肌纤维化过程。Thum等 [40] 发现Spry1可以负性调控细胞外调节蛋白激酶–丝裂原活化蛋白激酶(extracellular regulated protein kinesis-mitogen activated protein kinesis, ERK-MAPK)信号通路，促进纤维化。通过注射特定作用于miR-21的化学修饰的反义寡核苷酸到小鼠体内，并在横向主动脉缩窄导致的左心室压力超载的条件下，发现Spry1表达水平升高，丝裂原活化蛋白(mitogen activated protein, MAP)激酶活化以及纤维化。李红芳等 [41] 膜蛋白Spryl过表达或基因敲除对血管平滑肌细胞MAPK的调节作用)通过采用spyrl在原代培养的vsMc中条件性过表达或条件性敲除，发现Spryl过表达对静息状态或激活状态的R-afERKI/2和P38MAPK通路具有明显的抑制作用，可抑制ERK和P38磷酸化，而spyrl基因敲除则无影响。

4.2.2. microRNA-21与TGF-β在纤维化中的作用

TGF-β-Smads信号通路是介导心肌纤维化的重要通路，Smad蛋白是TGF-β信号传导的介质，并且在ECM合成和沉积的调节中起主要作用。Yang等 [42] 的研究也表明调节TGF-β信号通路和miR-21的表达能增强PI3Kα信号通路，降低心肌纤维化。TGF-β也能诱导内皮细胞向间质转化(endothelial to mesenchymal transition, EndMT)。Smad7是拮抗或抑制Smads，并且已被认为可以抑制TGF-β信号传导途径。Li等 [43] 设计了miR-21和Smad7之间具有突变结合位点的载体，结果证实Smad7是miR-21的直接靶标，其可以结合Smad7 mRNA的3'-UTR区域并沉默其翻译。在该信号传导网络中，Smad7是控制下游蛋白磷酸化并影响ECM合成的关键蛋白。当miR-21被敲除时，Smad7被上调，随后p-Smad2/3减少。从而导致TGF-β-Smads信号通路受阻，影响纤维化形成。

TGF-β受体III (TGF-βRIII)是一种TGF-β超家族的辅助受体，它在介导和调节TGF-β的信号转导具有重要的作用。MiR-21可直接或间接负性调节转化生长因子β受体III的表达来参与心肌纤维化的病理进程。Liang等 [44] 研究证实TGF-βⅢ型受体负性调控TGF-β信号通路，同时发现在小鼠心肌梗死边缘区的TGF-β和miR-21表达上调，而TGF-βⅢ型受体表达下调，且证实TGF-βⅢ是miR-21的靶基因，过表达TGF-βⅢ能抑制miR-21的表达和降低成纤维细胞合成胶原蛋白。表明在miR-21与TGF-βⅢ存在一个循环通路在心肌纤维化过程中发挥重要作用。

4.2.3. PTEN与microRNA-21在纤维化中的作用

PTEN是1997年发现的小分子基因，全长约200 kb。定位于人10号染色体q23.3区，它属于酪氨酸氨基酸磷酸酯酶家族。PTEN的功能包括控制肿瘤的生长、调控血管生长以及调控细胞周期等。Lorenzen等 [45] 研究发现，在血管紧张素II介导的心肌纤维化中，PTEN和Smad7作为microRNA-21的靶点，诱导心肌纤维化。Roy等 [46] 研究心肌缺血再灌注时发现PTEN是microRNA-21的一个目的靶基因，microRNA-21在心肌成纤维细胞内通过转录后水平降低PTEN的表达水平，进而参与心肌梗死后梗死区域胶原代谢及心肌纤维化的发生。microRNA-21表达的升高可导致磷酸酶和张力蛋白同系物( PTEN)通路激活，基质金属蛋白酶2 (MM-P2)的表达上升。

5. 展望

RIHD的心肌纤维化发生发展是一个缓慢且多种因素及机制参与过程，目前对于其病理机制研究尚不清楚。目前对放射性心肌损伤研究从细胞水平到动物水平，且发现多种机制参与其病理过程，但仍无统一且确切的结论。且放射所致心脏损伤发生时间缓慢，发病早期无任何症状将为其进一步治疗带来困难。目前仍未寻找到预防及逆转其损伤的方法。

基金项目

贵州省科技厅课题(黔科合LH字[2014]7135)；贵州省教育厅创新群体重大研究项目(黔教合KY[2016]032)。

NOTES

^*通讯作者。