摘要:
六斑刺鲀是一种极具养殖开发潜力的经济鱼类，广泛分布于我国东南沿海，肉质鲜美，鱼皮富含丰富的胶原蛋白。本文研究了六斑刺鲀受精卵的胚胎发育过程。刺鲀卵为浮性卵，浮在水面后聚成一片，略有粘性。卵子受精后原生质向动物极集中并逐渐隆起，胚盘形成，约经过20 min第一次分裂开始，以后约每20 min再分裂一次，受精2 h后为多细胞期。受精13 h后进入原肠期，21 h后发育至神经胚期，27 h后进入尾芽期。在盐度28~32，温度28℃~29℃，pH 7.2~8.5实验条件下，六斑刺鲀受精卵经过约83小时便可出膜。这是国内针对六斑刺鲀胚胎发育形态结构变化的首次报道。
Abstract:
Abstract
Porcupine puffer (Diodon holocanthus) was regarded as a significant commercial fish species with a high economic potential. Meat of them was delicious, and skin was rich in collage protein. Here, we explored the embryonic development of the fertilized eggs of D. holocanthus. The fertilized eggs were slightly sticky and floating egg that came together on the surface of the water. After fer-tilization, the protoplasm was concentrated towards the animal pole and gradually rised, and the blastoderm forms, which started after the first division in about 20 min, and then divided again about every 20 min. After fertilization, it was a multicellular stage after 2 h. After 13 h of fertiliza-tion, it entered the gastral stage, grew to the neuronal embryo stage after 21 h, then entered the tail bud stage after 27 h. Under the condition of this experiment, salinity 28 - 32, temperature 28˚C - 29˚C, pH 7.2 - 8.5, the fertilized egg could be out of the membrane after about 80 hours. This was the first report on the changes of embryonic morphological structure of D. holocanthus.
1. 引言
六斑刺鲀(Diodon holocanthus)隶属于鲀形目，二齿鲀科，刺鲀属(Diodon)，俗名气瓜仔、刺规等，为热带海洋性底层鱼类，仔、稚鱼时期随着大洋漂游生活，成鱼后则栖息于岩礁区之浅水域，不善游泳，行动缓慢。六斑刺鲀为肉食性，坚硬的颌齿可咬碎贝类、棘皮动物及螃蟹等无脊椎动物为食，其肉质鲜美，鱼皮富含丰富的胶原蛋白，深受市场欢迎。目前六斑刺鲀来源全部为海上捕捞，资源量也随着渔民过度捕捞成锐减趋势。
近年来，由于刺鲀具有食用、药用及观赏价值，其开发利用越来越受到关注。萧哲发现六斑刺鲀全身含河鲀毒素均低于7鼠当量/g，可视为无毒 [1] 。日本学者对安地列斯短刺鲀(Chilomycterus antillarum)和许氏短刺鲀(Chilomycterus schoepfii)进行了杂交(Hiroyuki, D. et al., 2015)以分析AFLP和mtDNA的片段在繁殖中的变化差异 [2] 。中科院水生所对六斑刺鲀基因组序列进行了研究，获得了776 kb非冗余基因 [3] 。有报道六斑刺鲀在游泳中的能量控制机制，测量了其向前及向后游泳中鱼鳍的动能、力学、协同方式以及游泳的姿态和泳速变化 [4] 。日本学者研究发现，5月份以后，水温在23℃以上，便可观察到性成熟的六斑刺鲀有互相追尾和产卵的行为 [5] 。然而，截至目前，该科鱼类人工繁殖方面的研究较少，这也在一定程度上制约了对刺鲀开发利用的进程。
六斑刺鲀资源群体数量不稳定，具有明显的季节性捕获量，所以总的渔获产量不高，市场也就供不应求。本研究通过在海南收集野生的亲本，通过人工驯化并通过一系列方法促进其性腺发育，成功获得受精卵，选择其中一批优质受精卵，观察并记录其胚胎发育的特征，以期为这一新兴养殖品种的繁养技术提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 亲本与孵化条件
经过前期六斑刺鲀野生亲鱼的市场调查和研究得出，挑选体质量在600 g以上，体长20 cm以上，体表无伤，健康活力好的野生六斑刺鲀为本研究所选亲鱼，在人工驯养及繁育阶段可得到较好的效果，繁殖前水质要求为盐度28~32，温度28℃~30℃，pH 7.2~8.5，溶氧保持 > 5 mg/L，流水饲养，流速50~80 L/min；养殖池直径4~5 m，水深1~1.5 m，放养密度为1~2尾/m3，每日饱食投喂活虾。在人工驯养条件下达到性成熟，接近产卵期，产卵前有3~4为雄鱼追逐一尾雌鱼的现象，雌鱼腹部膨大，生殖孔扩张呈粉红色，下午18点以后停止流水，当亲鱼自然产卵于亲鱼池中后，用抄网即时捞出浮在水面上的受精卵。六斑刺鲀性腺指数(生殖腺重量/体重 × 102)为19.4，雌鱼体重为540 g，体长21.6 cm，产卵约4.33万粒。
2.2. 观察记录
孵化期间以不同时间间隔多次取样，孵化时间3~4天。每次随机抽取15粒受精卵进行观察。以所观察样本中有50%表现出相应发育期特征为标准记录时间。胚胎在Olympus体视显微镜下观察各时期的形态特征，描述、记录胚胎发育时序和特征。用Olympus DP71显微数码相机或Canon 50D数码相机进行显微摄影。
3. 结果与分析
胚胎发育
刺鲀受精卵为圆球型，端黄卵，无色透明，聚集状油球20~30个，卵径1.697 ± 0.376 mm，胚胎发育过程见表1与图1 (图1放大倍数为100倍)。
Table 1. Embryonic development of Diodon holocanthus
表1. 刺鲀的胚胎发育
Figure 1. Embryonic development of Diodon holocanthus
图1. 刺鲀的胚胎发育
在水温为28℃~29℃条件下，从受精卵到孵化出膜约共83 h，卵子受精后原生质向动物极集中并逐渐隆起，胚盘形成，约经过20 min第一次分裂开始，以后约每20 min分裂再一次，受精后2 h后为多细胞期，而后受精卵的动物极形成多层细胞发育成为桑椹胚。
桑椹胚期以后，随着细胞分裂的持续，数目继续增加，胚胎发育至囊胚期。囊胚期之初，胚体呈现为帽状结构，即高囊胚，之后细胞体积不断变小，胚体继续向植物极延伸，逐渐进入低囊胚期。
受精13 h后，细胞开始向植物极下包，逐渐包围卵黄囊；在胚盘边缘加厚形成胚环，进入原肠早期。胚体下包1/2卵黄时，在一侧形成胚盾，胚胎进入原肠中期，之后胚体伸长。在原肠末期，胚体的最下方形成胚孔，并形成胚胎雏形。
受精21 h后，胚体的中央部分开始加厚，形成神经板，随后逐渐形成神经褶和神经管，胚体头部两侧向外隆起，在头部两侧形成眼泡，随后在胚体的腹面形成克氏泡，不久后胚孔封闭。
受精27 h后，尾芽与卵黄分离，胚体开始出现肌肉效应，胚体间断性收缩，不久后，胚体出现有节律的心跳，尾部出现颤动。黑色素细胞在躯干部排列，并逐渐变浓，胚体肌肉收缩力度加强，频率加快。74 h后，配体开始转动，以尾部率先挣破卵膜孵出。
4. 讨论
4.1. 六斑刺鲀人工繁殖
人工育苗技术一般包括野生原种的驯化，亲鱼培育疾病防治，营养添加促生长促性腺发育，产卵孵化，鱼苗培育以及生物饵料培养等一些过程，为了提供足够的优质苗种，培养亲鱼产生优质的卵子显得尤为重要。亲鱼的来源有两种途径：一是海捕，二是保种留种或者引种，本研究采用的是海捕野生亲本。本实验在水温28℃~30℃进行，在产卵前1~2天可以观察到六斑刺鲀有3~5尾雄鱼追1尾雌鱼的行为，而后在晚上会有产卵现象。日本学者研究发现，5月份以后，水温在23℃以上，便可观察到性成熟的六斑刺鲀有互相追尾和产卵的行为 [5] 。六斑刺鲀初孵仔鱼全长2.84 mm左右，个体在鲀科鱼类中尚属较小 [6] ，因此其育苗要较其它鲀科鱼类复杂，暗纹东方鲀育苗技术现已比较成熟，初孵仔鱼开口培育阶段中投喂初孵丰年虫便可获得较大的成活率 [7] [8] [9] ，六斑刺鲀鱼开口时口裂(1.1~1.3 mm)相对一般海水鱼类略大，卤虫幼体(0.4~0.6 mm)或者规格较小(0.5~0.7 mm)的桡足类完全能被吞咽但即使稚鱼可以摄食卤虫幼体，但仔鱼阶段的培育死亡率仍比较高，说明从内源性营养到外源性开口饵料转化没有成功，致死原因不排除外界环境条件和初孵仔鱼本身的质量问题。相比于东方鲀，六斑刺鲀人工繁育技术与其人工繁育技术还是存在一定的不同之处，具体机制还需后期进行深入的研究。
4.2. 六斑刺鲀胚胎发育
孵化率受水温及盐度等外界环境影响比较大，而内在因素如精卵成熟度及受精率也是关键影响因子 [10] [11] [12] 。在本实验盐度28~32，温度28℃~29℃，pH 7.2~8.5条件下，受精卵经过约80小时便可出膜。其他鲀类受精卵研究人员也进行过相关研究，比如在水温18.6℃~21.5℃条件下，暗纹东方鲀约139 h [13] ，而弓斑东方鲀约为169 h [14] ，与本研究中的六斑刺鲀孵化时间有很大差异，原因可能是鱼种类不同或者受不同孵化温度的影响，在适宜孵化温度条件下，温度越低孵化时间越长，低于某临界值时受精卵停止发育，而温度过高也会导致受精卵发育终止。此次试验受精卵全部为亲鱼在人工驯养环境下自然产卵，刺鲀卵为浮性卵，浮在水面后聚成一片，略有粘性，孵化时可采用充气增加水流，以避免粘连和堆叠造成卵霉，影响孵化率。
基金项目
中央级公益性科研院所基本科研业务费(2189-2018)。
NOTES
*通讯作者。