表油菜素内酯对烤烟叶片衰老及耐熟性的调节作用

Regulating Effect of Exogenous 2,4-Epibrassinolide on Senescence and Holding Ability of Flue-Cured Tobacco Leaves

摘要: 为了探索表油菜素内酯(EBR)对烤烟叶片耐熟性的调教效应，分别于中部叶和上部叶的定长期，采用不同浓度(0.2, 1.0, 10 μmol/L)的EBR溶液进行叶面喷施。结果表明，喷施EBR可以降低烤烟叶片中的氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)含量，减缓叶片衰老进程中SPAD值和细胞膜稳定指数(MSI)下降的速率，提高基于SPAD和MSI相对变化速率的烟叶耐熟性指数(I_SPAD和I_MSI)，改善烤烟叶片的耐熟性，提高烤后烟叶的单位面积产量、产值和上等烟比例。综合分析3种使用浓度对叶片衰老速率、耐熟性指数和烟叶经济性状的影响，大田使用以浓度为1.0 μmol/L的EBR效果较好。

Abstract: In order to explore the regulating effect of exogenous 2,4-epibrassinolide (EBR) on senescence and holding ability of flue-cured tobacco leaves, EBR solutions of different concentrations (0.2, 1.0, 10 μmol/L) were sprayed to middle and upper leaves at their fully expended stage. The results showed that contents of 1-aminoclopropane-1-carboxylic acid (ACC) in tobacco leaves were decreased and descent velocity of SPAD and membrane stability index (MSI) during leaf senescence was retarded by application of EBR. Therefore, holding ability index based on rate of relative change of SPAD (I_SPAD) and MSI (I_MSI) was increased. Considering the comprehensive effects of EBR on senescence, holding ability and economic characteristics of flue-cured tobacco leaves, the concentration of 1.0 μmol/L was recommended for field use.

1. 引言

烤烟是以叶片为收获对象的经济作物，烟叶在田间生长到一定阶段要进行采摘和烘烤，从成熟采摘到烘烤过程实际是叶片衰老的过程。与大多数农作物不同，研究其他作物衰老的目的是如何延缓衰老以提高产量，而在烟叶采摘及烘烤方面，是根据叶片衰老机理及影响衰老的因子，适时采收并促进采收的叶片在烤房内衰老，以促进叶片内含物降解并向有利于吸食的方向转化，使烤后烟叶达到最佳质量要求 [1] 。因此，适时采收烘烤是保证烤烟质量的重要环节。许多研究表明，适熟采收会使烟叶的质量提高，易于陈化和调制，而未熟或过熟收获的烟叶则质量降低，香吃味变劣 [2] [3] [4] [5] [6] 。不同部位的叶片生长发育的时序不同，烤烟的收获时期可持续4~8周 [7] 。在烤烟生产中，由于烘烤设备限制和劳动力紧缺等原因，常常不能保证田间生长的烟叶在最佳时期得到采收，导致烟叶质量降低。因此，烤烟的“耐熟性(holding ability)”日益得到研究者和生产者的关注 [2] [7] 。烤烟的耐熟性是指烟叶显现成熟特征后，田间可以持续发育且不腐烂的能力，俗称“吊得住” [8] 。也可理解为烟叶保持适熟采收期的能力。它取决于烟叶的生理代谢和成熟衰老进程，而且受品种、施肥量、生长季节雨量、温度等环境条件的影响 [2] [5] 。目前关于烟叶的成熟度与质量的关系，以及不同成熟度烟叶的形态与生理指标已有许多研究 [9] - [15] ，但关于烟叶耐熟性及其调节，研究较少 [7] [8] 。

表油菜素内酯(Epibrassionolide)是一种人工合成的高活性油菜素内酯类似物，对植物代谢和生长发育具有显著的调节作用，可以促进细胞伸长和分裂，提高光合能力，增强植物的抗逆性，调节光合产物运转，影响衰老进程等等 [16] [17] [18] [19] [20] 。用于烟草，可以促进种子萌发、根的生长、改善烟叶化学成分的比例 [21] [22] 。目前，关于BR对植物的生理效应及作用机理研究已经比较深入，但关于BR对烤烟叶片的成熟衰老进程及耐熟性的影响，尚不清楚。鉴于上述情况，本文研究了2,4-表油菜素内酯(2,4-epibrassinolide, EBR)对烤烟叶片成熟衰老和烟叶耐熟性的影响，旨在为改善烟叶的耐熟性和经济性状提供依据。

2. 材料与方法

2.1. 试验条件与试验设计

以烤烟(Nicotiana tabacum)品种K326为材料，试验于2018年在湖南省湘西自治州龙山县召市镇进行。该县位于东经109˚13'~109˚46'8''、北纬28˚46'7''~29˚38'4''之间，属亚热带大陆性湿润季风气候区，县域年平均气温15.8℃，年平均降水量为1376.2毫米。试验地地势平坦，排灌方便，土壤类型为壤土，有机质含量15.75 g/kg，碱解氮含量94.11 mg/kg，有效磷含量40.68 mg/kg，速效钾含量113.47 mg/kg。采用随机区组试验设计，设置4个处理：EBR1：叶面喷施浓度为0.2 μmol/L的EBR；EBR2：叶面喷施浓度为1.0 μmol/L的EBR；BR3：叶面喷施浓度为10.0 μmol/L的EBR；Control：叶面喷施清水，作为对照。分别于中部叶和上部叶的定长期喷施。每个时期喷施2次，两次喷施间隔1天。叶片正反两面均匀喷施，喷施量掌握在烟叶表面即将有药液下滴为度。

移栽期为2018-05-05，移栽行距110 cm，株距50 cm，种植密度为18,182株/hm²。每个小区种烟8行，行长10 m。现蕾打顶，单株留叶18片，田间管理按当地常规措施进行。

2.2. 测定测定项目与方法

2.2.1. ACC (氨基环丙烷-1-羧酸)含量

于喷施处理后48 h取样，立即以干冰封存，由南京卡文思检测技术有限公司采用液相色谱-质谱联用技术进行测定。

2.2.2. SPAD值

于喷施处理后第3 d开始，每隔2 d测定1次。采用Chlorophyll Meter Model SPAD-502 Plus (日本，岛津公司)，参照曾建敏等方法 [23] 测定。并根据下式计算基于SPAD值的耐熟性指数。

$I_{SPAD}=1/\left[\left(SPA{D}_n-SPA{D}_{n+1}\right)/SPA{D}_n\right]$ (1)

式(1)中，I_SPAD为基于SPAD的耐熟指数；SPAD_n为适熟期(工艺成熟期)烟叶的SPAD值； $SPA{D}_{n+1}$ 在为3天后烟叶SPAD值。

2.2.3. 细胞膜稳定指数

于喷施处理后第3 d开始，每隔2 d测定1次。参照Singh等方法 [24] ，采用DDSJ-318型电导率仪测定。根据下式计算细胞膜稳定指数(MSI)：

$MSI=\left(1-相对电导率\right)\times 100$ (2)

在此基础上，根据下式计算基于MSI的耐熟性指数。

$I_{MSI}=1/\left[\left(MS{I}_n-MS{I}_{n+1}\right)/MS{I}_n\right]$ (3)

式(3)中，I_MSI为基于MSI的耐熟指数；MSI_n为M2适熟期(工艺成熟期)烟叶的MSI值； $MS{I}_{n+1}$ 在为3天后烟叶MSI值。

2.2.4. 烟叶成熟度判断与采收烘烤

参照陈逸鹏等 [25] 和孙阳阳等 [9] 的方法进行成熟度判断。适熟期(工艺成熟期)进行采收，按照“8点式”烘烤工艺进行烘烤 [26] ，对烤后烟叶进行经济性状分析。

2.3. 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据整理，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，并用Duncan法进行处理间差异显著性检验(α = 0.05)。

3. 结果与分析

3.1. EBR对烤烟叶片ACC含量的影响

ACC是乙烯生物合成的直接前体，与叶片的乙烯释放量具有密切关系 [27] 。测定的结果(表1)表明，外源EBR导致叶片的ACC含量降低，而且随着使用浓度提高，ACC含量下降幅度增大。中部叶和上部叶变化趋势一致。

Table 1. Effect of EBR on ACC content in flue-cured tobacco leaves

表1. EBR对烤烟叶片ACC含量的影响

注：同一列中不同字母表示差异达到5%显著水平。

3.2. EBR对烤烟叶片SPAD值的影响

烤烟叶片的SPAD值与叶绿素含量呈极显著的正相关，可用SPAD值来反映叶绿素含量的相对水平 [23] 。表2和表3所示分别为中部叶和上部叶衰老进程中SPAD值的变化动态，可以看出，不论是中部叶还是上部叶，均随着叶片衰老进程的推进，SPAD值呈减小趋势。使用外源EBR对SPAD值降低具有延缓作用，并且表现出浓度效应，随着使用浓度增大，延缓效果提高。

Table 2. Effect of EBR on SPAD values in middle leaves of flue-cured tobacco cultivar “K326”

表2. EBR对K326中部烟叶SPAD值的影响

Table 3. Effect of EBR on SPAD value in upper leaves of flue-cured tobacco cultivar “K326”

表3. EBR对K326上部烟叶SPAD值的影响

3.3. EBR对烤烟叶片细胞膜稳定指数的影响

植物在逆境和衰老的情况下，体内清除活性氧的能力失去平衡，细胞膜脂过氧化作用加剧，导致细胞膜的结构与功能受损，膜透性增大 [24] [28] 。测定结果(表4、5)表明，在烤烟叶片的衰老进程中，细胞膜稳定指数(MSI)呈持续降低的趋势。与对照相比较，喷施EBR可以提高叶片的MSI，其效果大小依次为EBR3 > EBR2 > EBR1。

3.4. EBR对烤烟叶片耐熟性指数的影响

表6所示为根据SPAD值和MSI计算的烤烟叶片耐熟性指数(I_SPAD和I_MSI)。可以看出，虽然两种耐熟性指数的绝对值不同，但总体变化趋势是一致的。与对照相比，EBR处理使I_SPAD和I_MSI提高，且表现出浓度效应，即随着EBR浓度增大，耐熟性指数增幅加大。上述结果表明喷施EBR具有改善烤烟叶片耐熟性的效应。

Table 4. Effect of EBR on membrane stability index in middle leaves of flue-cured tobacco

表4. EBR对烤烟中部叶的细胞膜稳定指数(MSI)的影响

Table 5. Effect of EBR on membrane stability index in upper leaves of flue-cured tobacco

表5. EBR对烤烟上部叶的细胞膜稳定指数(MSI)的影响

Table 6. Effect of EBR on holding ability index in middle and upper leaves of flue-cured tobacco

表6. EBR对烤烟中部叶和上部叶耐熟性指数的影响

3.5. EBR对烤烟叶片经济性状的影响

从表7可见，外源EBR对烤烟的产量、产值和上等烟比例具有明显影响。单位面积产量以EBR3处理最高，依次为EBR2、EBR1和对照，但EBR3与EBR2之间差异不显著。单位面积产值以EBR2最高，依次为EBR3、EBR1和对照，处理之间差异显著。上等烟比例也是以EBR2最高，其次是EBR3和EBR1，二者之间差异不显著，但均显著高于对照。

Table 7. Changes in yield, output value and fine tobacco ratio of flue-cured tobacco with different treatments

表7. 不同处理烤烟产量、产值及上等烟比例变化

注：同一列中不同字母表示差异达到5%显著水平。

4. 结论与讨论

20世纪60年代以来，许多科学家对高等绿色植物叶片衰老机理及影响因素进行了大量研究，并取得了很大进展，形成了自由基伤害学说、内源激素调节学说和细胞程序性死亡学说等理论 [29] 。根据激素调节学说，植物叶片的衰老受体内激素水平的调控，其中乙烯(ETH)能够促进衰老，加快衰老相关基因表达。ACC是植物体内乙烯生物合成的直接前体，ACC的合成是乙烯生物合成途径中的限速步骤，乙烯释放量取决于ACC水平的高低 [27] 。因此，人们常常通过测定ACC含量来探讨乙烯对植物的调节作用。通过测定发现，采用EBR处理，可以导致烤烟叶片的ACC含量显著降低，并且表现出浓度效应，意味着EBR具有抑制乙烯释放，延迟烤烟叶片衰老的效应。在植物衰老的进程中，由于体内的活性氧清除能力下降，导致活性氧积累，膜脂过氧化作用加剧，细胞膜透性增大 [1] [28] [30] 。本文的测定结果佐证了这一观点，随着烟叶衰老进程的推进，根据细胞膜透性计算的膜稳定指数(MSI)呈持续下降趋势。与对照比较，外源EBR能够减缓MSI降低的速率，提高细胞膜结构和功能的稳定性。3个使用浓度的效果依次为EBR3 > EBR2 > EBR1，表明在一定范围内具有浓度效应。在植物叶片的衰老过程中，会发生复杂的形态和生理变化，最明显的外观标志是叶色由绿变黄，而在细胞水平上表现为叶绿素降解，蛋白质含量下降，光合磷酸化能力降低等等 [31] 。因此，叶绿素含量常被用作叶片衰老的生理指标。由于叶绿素仪(SPAD仪)可以快速、便捷和无损检测叶片的叶绿素相对含量，已被成功地用于农作物叶绿素和氮素营养水平的跟踪监测。一些研究 [10] [23] [32] 表明，烤烟叶片叶绿素含量与SPAD值呈极显著的正相关；孙阳阳等 [9] 研究认为SPAD值可作为快速判定烟叶成熟度的量化指标。从测定结果可见，在烤烟叶片的衰老进程中，SPAD值呈持续降低趋势，EBR处理可以延缓叶片SPAD值的降低速率，且随着使用浓度增大，延缓效果提高，与刘海英等以小麦为材料的研究结果一致 [33] 。Bowman [7] 较早地提出了烤烟耐熟性(holding ability)的概念，并提出根据不同时期采收烟叶的单位面积产值来判断烟叶的耐熟性；张德龙等 [8] 建议采用烟叶呈现成熟特征以后相同时间内丙二醛、叶绿素含量的变化速率判定烟叶的耐熟性，变化速率越大，耐熟性越弱。借鉴前人研究，并考虑到测定方法要简便、快速，易于田间测定，不同品种和不同生态条件下要有较好的可比性等因素，基于本试验的结果，提出了根据SPAD和MSI相对变化速率计算的耐熟性指数(I_SPAD和I_MSI)，I值过小，表明叶片衰老速度较快，烟叶耐熟性较差；I值过大，意味着叶片衰老速度过于缓慢，容易造成迟熟或不易成熟；耐熟性较好的烟叶则I值大小适中。从测定和计算结果(表6)可以看出，喷施EBR可以提高烟叶的I_SPAD和I_MSI值，其效果随着使用浓度提高而增大。综合考察烟叶的耐熟性指数和烤后烟叶的经济性状，并考虑到使用成本，大田应用中以EBR2处理的浓度(1.0 μmol∙L⁻¹)较好。

基金项目

湖南中烟工业有限责任公司科技项目“烤烟耐熟性评价方法及调控技术研究(KY2016YC0002)”。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。