1. 引言
依诺肝素钠是新一代肝素类抗血栓药物，其分子量和分子量分布是其重要的质量控制指标。目前美国药典(USP 42)，欧洲药典(EP 9.7)，英国药典(BP 2018)均有收录依诺肝素钠 [1] [2] [3] ，均采用凝胶渗透色谱对其进行检测，通过GPC软件计算其分子量和分子量分布，其重均分子量为3800 Da~5000 Da，小于2000 Da的组分所占比例为12%~20%，2000 Da~8000 Da所占的比例为68%~80%。其中USP 42依诺肝素钠分子量和分子量分布检查项是通过两个窄分布的分子量对照品(含有七个已知分子量对照品)作标准曲线，和一个已知重均分子量的对照品进行系统适用性验证后，进行分子量检测；EP 9.7和BP 2018是通过一个宽分布对照品，通过手工取点作标准曲线进行分子量检测 [4] [5] [6] [7] 。
在分子量测定过程中EP对照品通过特殊的解聚方法在每一分子上引入一个发色团，在234 nm波长处有最大吸收，检测时需串联紫外检测器和示差检测器，紫外检测器响应值和摩尔浓度成正比，而示差检测器响应值和质量浓度成正比，两者比值和依诺肝素钠分子量成正比，比例常数的确定使用了对照品的数均分子量(Mna = 3800)，因此需通过复杂的计算和手工取点的方式才能得到校正曲线。而WHO对照品提供了宽分布标样表，即分子量与累积面积百分比的对应表，检测时仅使用示差检测器，且不用分离出寡糖峰，检测和计算过程比较简便 [6] [8] - [13] 。
2. 实验部分
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验药品
EP低分子肝素分子量对照品(Heparin Low-Molecular-Mass for Calibration CRS，EP对照品。数均分子量Mna = 3800)从欧洲药监局购买，批号为batch 3。
WHO低分子肝素分子量对照品(Low Molecular Weight Heparin for Molecular Weight Calibration，WHO对照品)从英国国家生物制品检定所购买，批号为05/112。
依诺肝素钠CRS (Enoxaparin Sodium CRS，重均分子量标示量为4480 Da)从欧洲药监局购买，批号为batch 5。
依诺肝素钠注射液(克赛®)购自赛诺菲安万特公司，批号为4SC98、5SA66、5SL48。
依诺肝素钠原料药为国内某公司生产，批号为150402、150403。
依诺肝素钠注射液为国内某公司生产，批号为160202、160203。
2.1.2. 仪器与试剂
岛津高效液相色谱仪20 A (紫外检测器、示差检测器、ALS自动进样器、二元泵)，MS205DU型电子分析天平(METTLER TOLEDO)。
D-(+)-葡萄糖为优级纯(百灵威科技)；葡聚糖2000为优级纯(上海迈瑞尔化学技术有限公司)；硫酸、硫酸钠、醋酸铵为分析纯(西陇化工股份有限公司)；水为娃哈哈纯净水。
2.2. 实验方法
2.2.1. 硫酸钠体系
1) 色谱条件：色谱柱：TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)；柱温：30℃；紫外检测器和示差检测器联用，紫外检测波长：234 nm，示差检测器温度：35℃；流速：0.5 mL·min−1；进样量：25 μL；流动相：0.2 mol·L−1硫酸钠水溶液(硫酸调pH值5.0)。
2) 溶液的制备：供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量，分别加硫酸钠流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液，分别作为供试品溶液1。
系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为系统适用性溶液1。
EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为EP对照品溶液1。
WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL硫酸钠流动相使溶解，作为WHO对照品溶液1。
3) 实验过程：
专属性和系统适用性试验
分别取空白溶剂(0.2 mol·L−1硫酸钠水溶液)、“1.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、系统适用性溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL，注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰；系统适用性溶液1示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为21379，葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为8.80；依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.196 min)和葡聚糖2000 (保留时间为12.035 min)的保留时间之间。色谱图见图1。
1(a) 空白溶剂；1(b) 系统适用性溶液1；1(c) EP对照品溶液1；1(d) WHO对照品溶液1；1(e) 依诺肝素钠CRS供试品溶液1
Figure 1. Chromatogram 1 of specificity and system suitability tests of sodium sulfate system
图1. 硫酸钠体系专属性和系统适用性试验色谱图1
样品测定精密量取“2.2.1”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液1、EP对照品溶液1、WHO对照品溶液1各25 μL，注入液相色谱仪，记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800)，采用手工取18个点，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；根据WHO对照品宽分布标样表，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表1，样品测定结果见表2。
Table 1. Reference calibration curve of sodium sulfate system
表1. 硫酸钠体系对照品校正曲线
Table 2. Determination results of samples by sodium sulfate system
表2. 硫酸钠体系样品测定结果
2.2.2. 醋酸铵体系
1) 色谱条件：色谱柱：TSK G2000SWxl (7.5 mm × 300 mm)；柱温：30℃；紫外检测器和示差检测器联用，紫外检测波长：234 nm，示差检测器温度：35℃；流速：0.5 mL·min−1；进样量：25 μL；流动相：0.1 mol·L−1醋酸铵水溶液。
2) 溶液的制备:
供试品溶液的制备供试品溶液的制备分别取依诺肝素钠CRS、依诺肝素钠注射液(克赛)、依诺肝素钠(自制)、依诺肝素钠注射液(自制)适量，分别加醋酸铵流动相溶解并稀释成每1 mL中约含依诺肝素钠10 mg的溶液，分别作为供试品溶液2。
系统适用性溶液的制备分别精密称取葡聚糖2000和葡萄糖各约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为系统适用性溶液2。
EP对照品溶液的制备精密称取EP对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为EP对照品溶液2。
WHO对照品溶液的制备精密称取WHO对照品约10 mg，置1.5 mL离心管中，精密加入1 mL醋酸铵流动相使溶解，作为WHO对照品溶液2。
3) 实验过程：
专属性和系统适用性试验
分别取空白溶剂(0.1 mol·L−1醋酸铵水溶液)、“2.2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、系统适用性溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL，注入液相色谱仪。空白溶剂不干扰本品出峰；系统适用性溶液2示差色谱图中理论板数按葡萄糖峰计算为22077，葡萄糖峰和葡聚糖2000峰分离度为9.22；依诺肝素钠CRS、EP对照品和WHO对照品示差色谱图中主峰保留时间在葡萄糖(保留时间为22.200 min)和葡聚糖2000 (保留时间为11.964 min)的保留时间之间。色谱图见图2。
2(a) 空白溶剂；2(b) 系统适用性溶液2；2(c) EP对照品溶液2；2(d) WHO对照品溶液2；2(e) 依诺肝素钠CRS供试品溶液2
Figure 2. Chromatogram 2 of specificity and system suitability tests of ammonium acetate system
图2. 醋酸铵体系专属性和系统适用性试验色谱图2
样品测定精密量取“2.2”项下依诺肝素钠CRS供试品溶液2、EP对照品溶液2、WHO对照品溶液2各25 μL，注入液相色谱仪，记录紫外和示差色谱图。根据EP对照品(Mna = 3800)，采用手工取18个点，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；根据WHO对照品宽分布标样表，以logM对保留时间T作三阶校正曲线，计算各供试品溶液的分子量和分子量分布；EP对照品和WHO对照品的校正曲线表见表3，样品测定结果见表4。
Table 3. Reference calibration curve of ammonium acetate system
表3. 醋酸铵体系校正曲线
Table 4. Determination results of samples by ammonium acetate system
表4. 醋酸铵体系样品测定结果
3. 结果讨论
伯小霞等 [4] 对比研究了依诺肝素钠分子量测定的EP和USP的方法，由于USP的分子量标准品采用七个窄分布的对照品，取点太少，存在一定误差，因此测定结果较EP的方法有一定偏离。而本文通过对比研究EP对照品和WHO对照品分别在两种流动相体系下(硫酸钠流动相和醋酸铵流动相)，对依诺肝素钠CRS (EP，bacth 5)、依诺肝素钠注射液(克赛®批号：4SC98、5SA66、5SL48)、依诺肝素钠(批号：150402、150403)、依诺肝素钠注射液(批号：160202、160203)的分子量和分子量分布进行计算，两种宽分布对照品对依诺肝素钠重均分子量差值均在100 Da以内，其分布差值在1%以内，表明两种宽分布对照品计算结果无显著性差异。李京 [14] 等通过对比高效体积排阻色谱法和体积排阻色谱法和多角激光光散射联用测定低分子量肝素分子量和分子量分布的结果接近，测定结果和本文所述结果一致。
从计算过程中不难发现，EP对照品需串联紫外检测器和示差检测器，并计算两个检测器的延迟时间，且取点过程非常复杂，还需应用EXCEL协助计算；而WHO对照品只需根据宽分布标表即可计算，相对简单，易于操作。目前，中国药典2015年版二部仅收录了肝素钠，其分子量对照品为类似于WHO的宽分布对照品并提供了分子量表。包括依诺肝素钠在内的低分子量肝素还没有分子量测定国家对照品，本文研究结果对该品种国家对照品的研制有重要意义。
致谢
本文在研究过程中得到校企合作单位鲁南制药集团大力支持，在此表示感谢。
NOTES
*通讯作者。