表观遗传对成骨细胞的调控作用及与骨质疏松的关系

The Role of Epigenetics in the Regulation of Osteoblasts and the Relationship with Osteoporosis

摘要: 目前表观遗传学的研究正愈加受到重视，表观遗传不通过改变DNA的编码顺序也可以调控基因的表达，而DNA甲基化和组蛋白乙酰化作为表观遗传学的重要机制，更是目前表观遗传学研究的热门方向。DNA的甲基化和去甲基化，组蛋白的修饰之间是否达到平衡更是保证干细胞向成骨细胞正常分化的关键。基因表达时序性被打破不仅会影响到成骨分化，更与骨科类疾病，如骨质疏松有密切的联系。本文主要综述了近年来DNA甲基化、组蛋白乙酰化和miRNA对成骨细胞分化的调控作用及其与骨质疏松关系的最新研究进展。

Abstract: At present, epigenetics is getting more and more attention. Epigenetics can also regulate gene expression without changing the coding sequence of DNA, and DNA methylation and histone acetylation, as important mechanisms of epigenetics, are the hot research directions of epigenetics. The balance between DNA methylation, demethylation and histone modification is the key to ensure the normal differentiation of stem cells into osteoblasts. The disruption of gene expression timing not only affects osteogenic differentiation, but also is closely related to orthopedic diseases, such as osteoporosis. In this paper, the recent advances in DNA methylation, histone acetylation and miRNA regulation of osteoblast and osteoclast differentiation and their relationship with osteoporosis were reviewed.

1. 引言

表观遗传是指基于非基因序列改变所致基因表达水平的变化，主要包括DNA甲基化，组蛋白修饰，微小RNA (microRNA, miRNA)等 [1] 。近年来，研究表明表观遗传学对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)分化为成骨细胞和破骨细胞有重要的调控作用，其可以通过调节雌激素内分泌途径、Wnt/β-catenin信号通路、OPG/RANKL/RANK系统、维生素D内分泌途径及其他代谢相关途径中的基因表达，调控成骨细胞和破骨细胞的分化和活性，从而参与骨质疏松疾病的发生发展 [2] [3] 。本文主要从DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等方面对成骨细胞和破骨细胞分化的调控作用及其与骨质疏松的关系进展进行综述，进而揭示表观遗传学在骨修复和骨质疏松中的重要意义。综述通过对文献进行整理，阐述了表观遗传学对成骨细胞和破骨细胞的调控关系以及对骨质疏松症的影响，希望能够为临床治疗提供理论依据。

2. 表观遗传学对成骨细胞分化的调控

2.1. DNA甲基化对成骨细胞分化的调控

DNA甲基化是参与表观遗传学调控的重要机制之一，其机制是通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)将具有活性的甲基添加到胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸中胞嘧啶的C5位点上，影响基因的表达活性，从而对基因的表达起到一定的调控作用 [4] 。DNA启动子的甲基化与去甲基化均可以调控相应基因靶点的表达，进而调控MSCs向成骨细胞分化。自从首次报道基因组细胞上存在甲基群以来，解密DNA甲基化的功能已成为研究热点，主要集中在启动子、CPG岛上 [5] 。但关于DNA甲基化在增强子中的作用仍然存在一些悬而未决的问题。胡晓青等 [6] 研究发现，在MSCs向成骨细胞分化的过程中，DNA甲基化，组蛋白修饰都会发生显著地动态变化，Runx-2启动子区域；转录激活相关的组蛋白乙酰化H3K9和三甲基化H3K4表达上调，而与转录抑制相关的三甲基化H3K9降低，这表明MSCs成骨分化过程中Runx-2的表达与其基因启动子区域的遗传修饰紧密相关 [7] 。Jesus等 [8] 在骨硬化蛋白(Sclerosteosis, Sost)中发现了两个富含CPG的区域：1区域位于近端启动子，2区域位于外显子1周围，他们的甲基化特异性检测(qMSP)和DNA甲基化的焦磷酸测序分析实验的结果表明，在所有样本中，2区域均大量甲基化，相比于1区域有明显差异，而在成骨细胞中富含CPG的区域1呈高甲基化，但是这个区域在显微解剖的人类骨细胞中主要表现为低甲基化。这项研究有力的表明，DNA甲基化参与了成骨细胞至骨细胞转化过程中SOST表达(SOST基因编码的硬化蛋白，由骨细胞产生，是一种强有力的骨形成抑制剂)的调控，从而调控骨的形成。同时发现，对于成骨细胞和破骨细胞分化以及成骨细胞向骨细胞转化的关键基因数量受到DNA甲基化的影响 [9] [10] [11] 。

2.2. 组蛋白修饰对成骨细胞分化的调控

“组蛋白密码”学说 [12] 认为，通过对组蛋白尾巴(八聚体组蛋白亚基的游离氨基端)上的许多残基进行修饰(修饰的方式有甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化、ADP-核糖基化、生物素化、脯氨酸异构化等)可形成不同的信号因子，当被其他的蛋白质识别并产生蛋白质活动时即能影响基因的表达。染色质是一种智能构建模块，可通过结构变化表达外部或内部需求。迄今为止，有三种改变染色质结构和调节基因表达的方法已被充分证明：组蛋白修饰，组蛋白交换和ATP依赖性染色质重塑，越来越多的文献表明，组蛋白尾部切割与各种细胞过程有关，包括干细胞分化，破骨细胞分化，粒细胞分化，乳腺分化，病毒感染，衰老和酵母孢子形成 [13] 。从染色质结构来看，组蛋白裂解如何影响基因表达的潜在机制才刚刚开始研究，这个过程是一个涉及染色质动力学的新型转录表观遗传机制。成骨细胞-祖细胞向成熟成骨细胞的分化过程里，其中一个为通过成骨细胞特异性基因转录起始位点组蛋白3赖氨酸27 (H3K27)的n端修饰(乙酰-ac或甲基-me)重构核糖体组织，其研究发现成骨细胞启动子在分化过程中经历了从压抑状态(H3K27me3)到活跃状态(H3K27ac)的动态变化，通过EZH2的Polycomb压制复合体(PRC2)和通过BAFA45A(3)的Brg1关联复合体( Brg1 Associated complex, BAF)共同协调该过程，其中PRC2复合物主要负责H3K27me3的沉积，而BAF通过染色质重塑与H3K27ac的修饰相关，平衡这些相反的修饰配合物，以助于骨骼的形成 [5] 。组蛋白修饰过程中特异性组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)起重要的作用，其常与几种骨相关转录调控因子组成复合体，在微环境中调控成骨细胞相关基因表达，包括Runx-2、NFATc1、Zfp521和Pbx1 [14] 。Runx-2 转录蛋白与DNA链直接结合，调控DNA链中骨钙素(Osteocalcin, OCN)、I型胶原(Collagen type I, ColI)，骨涎蛋白(Bone sialoprotein, BSP)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)等目的基因的成骨表达 [15] ，在成骨发育中具有不可替代的作用。Runx2转录蛋白与DNA链直接结合，调控DNA链中碱性磷酸酶、I型胶原、骨钙素等目的基因的成骨表达。组氨酸去乙酰化酶6结合于Runx2蛋白的羧基端，构成HDAAC6/Runx2转录复合体，调控Runx2蛋白的促成骨活性。

2.3. miRNA对成骨细胞分化的调控

miRNA是一类小RNA分子，可以在转录后水平降低靶基因的表达 [16] 。它可以通过与靶基因的3'非翻译区(3'-UTR)结合来调节转录后基因的表达，从而导致mRNA降解和转录抑制 [17] 。miRNA对细胞发育，细胞分化，细胞增殖，细胞周期调控和代谢等大部分生物过程中的调控发挥着关键作用 [18] 。Li等 [19] 发现了一种miRNA-2861，其可通过抑制HDAC5的表达来促进成骨细胞的分化。在骨形成蛋白2 (Bone morphogenetic protein2, BMP2)诱导骨形成的过程中，miR-2861过表达增强了BMP2诱导的骨形成作用，抑制 miR-2861的表达，骨形成作用则相对减弱。miRNA可影响其他增强或抑制Runx-2表达水平的基因的表达，也可以通过直接靶向其基因与Runx-2相互作用。miR-133靶向Runx-2，mRNA，从而抑制BMP-2诱导的小鼠C2C12细胞的成骨细胞分化。

3. 表观遗传学对骨质疏松的影响

3.1. DNA甲基化对骨质疏松的影响

MSCs成骨分化的DNA甲基化修饰机制出现障碍，不仅会影响细胞的正常分化，并且与多种骨骼疾病的发生，包括骨质疏松和骨关节炎等密切相关 [20] 。Datta等 [21] 在破骨细胞功能所必需的大多数基因中观察到低甲基化，其中包括抗酒石酸抗性酸性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase, TRACP)，组织蛋白酶K (Cathepsin K, CTSK)和树突状细胞表达七种跨膜蛋白(TM7SF4, DCSTAMP等)。这些基因都伴随着低甲基化的表达而增加。此外，经历DNA甲基化变化的区域富集了转录因子激活蛋白1 (Transcription factors activate proteins1, AP-1)，核因子B (Factor-kappa B, NF-kB)和PU.1mRNA的结合基序，其均是破骨细胞生成中的关键转录因子。PU.1在破骨细胞分化过程中驱动DNA甲基化具有重要作用。杨士珍等 [22] 利用DNA甲基化芯片技术检测了髋部骨关节炎和髋部骨质疏松骨折患者的骨样本，探讨全基因的DNA甲基化模式在两种疾病中的差异，其结果显示共有241个CPG位点的甲基化状态出现明显的差异。这些研究表明，DNA甲基化修饰的表观遗传学机制出现异常不仅会影响到干细胞成骨分化功能，而且与骨质疏松症的发生发展有密不可分的关系。

3.2. 组蛋白修饰与骨质疏松症的关系

参与组蛋白修饰的酶主要有组蛋白乙酰转移酶(histone acetyl transferase, HAT)、组蛋白激酶(histone kinase)和组蛋白泛素化酶(histone ubiquitylase)等。其中组蛋白去甲基化酶Jmjd3和KDM4B被证实与骨质疏松症有密切的联系。Jmid通过与miR-146a的共同作用可以调控激活性T细胞细胞核因子(NFATc1)的活性，而NFATc1活化及转移受RANKL和其相应的受体结合的诱导，并通过诱导多种目的基因的表达来促进破骨细胞的分化；由活化的T细胞分泌的RANKL通过与其受体RANK结合而起破骨细胞活化因子的作用，RANK在前促细胞上表达。RANKL-RANK结合诱导前促细胞中几种转录因子的活化，并启动驱动破骨细胞分化和成熟的几种下游信号传导途径。由成骨细胞，骨髓基质细胞和Treg细胞分泌的OPG充当可与RANKL结合并随后阻止RANKL-RANK结合的可溶性受体。在生理条件下，OPG/RANKL处于平衡状态并保持骨骼稳态。在骨质疏松症条件下，RANKL上调，这与OPG的下调有关(图1) [23] 。同时Zhang [24] 等证实RANKL直接受miR-338-3p调控，RANKL的重新引入可以逆转miR-338-3p对破骨细胞形成和骨吸收的抑制作用。而KDM4B受到人重组骨形成蛋白(BMP)信号系统调控，并可以通过调节DLX基因族从而促进MSCs成骨分化，提示我们KDM4B与骨质疏松症相关。

3.3. miRNA与骨质疏松症的关系

miRNA能控制成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞相关的骨重建 [25] [26] [27] 。miRNA介导机制的失调逐渐成为骨变性和其他骨相关疾病中的重要病理因素，一项临床相关研究显示 [16] ，编码miR-2861的基因组中的纯合突变导致两名青少年患者出现罕见的家族性骨质疏松症。在其细胞培养模型中，BMP2在小鼠成骨细胞中诱导miR-2861的表达，这种miR-2861的表达增强抑制了表观遗传调节因子HDAC5的表达。该酶从组蛋白和其他调节蛋白(例如Runx2)中的赖氨酸残基去除乙酰基，抑制成骨细胞分化，并且在骨活组织检查中发现miR-2816表达缺失与HDAC5水平升高和RUNX2水平降低相关。并且miR-155、miR-211和miR-214 [28] 和一些可下调破骨细胞分化抑制性基因的表达可以促进破骨细胞的分化。miRNA-125b与SP7转录因子参与调节成骨细胞的分化，因此，miRNA的功能障碍可以破坏骨骼重塑，并通过减弱成骨细胞的骨合成代谢功能而导致骨质疏松症。Xaver F等人调查了36名患者的μCT (9.3 μm)扫描的特发性骨质疏松症中的19种miRNA生物标志物与骨微观结构的血清水平和骨组织形态学之间的关联。发现4种miRNA与骨微结构相关，7种miRNA与动态组织形态学相关。三种miRNA，即miR-29b-3p，miR-324-3p，和miR-550a-3p显示与骨形成的组织形态学参数以及微观结构参数显著相关，miR-29b-3p和miR-324-p在接受治疗的患者中减少 [29] 。这是首次报道骨相关miRNA的血清水平，可能揭示骨微结构的变化。尽管这些发现增强了循环miRNA作为骨生物标志物的潜在价值，但还需要进一步的实验研究来鉴定miRNA的临床效用以反映骨形成和微结构的动态变化。

Figure 1. Adjusting the steady-state sketch of bone by OPG/RANK/RANKL system

图1. 通过OPG/RANK/RANKL系统调节骨稳态示意图

4. 小结与展望

甲基化的DNA、组蛋白乙酰化、miRNA等可以调控成骨细胞和破骨细胞的分化。同时，人体骨组织中的DNA甲基化水平和相关蛋白的表达反映了表观遗传学在骨质疏松中的作用。表观遗传调控与骨稳态密切相关，基于表观遗传的疗法已经显示出治疗骨质疏松症的潜力，表观遗传学在骨科中的应用越来越具有前景，相信在将来，我们可以通过对表观遗传学的研究，在骨科类疾病的治疗中探索出新的治疗方向与方法。

致谢

本文由四川省科技厅项目(2018JY0348)，国家自然科学基金项目(51402027)，国家级大学生创新创业训练计划项目(201811079019)和成都大学大学生创新创业训练计划项目(CDU_CX_2019392，CDU_CX_2019393，CDU_CX_2019394，CDU_CX_2019395，CDU_CX_2019396)资助。

NOTES

^*共同第一作者。

^#通讯作者。