摘要:
目的：通过高相液相色谱法建立一种快速测定洋金花中莨菪碱含量的方法。方法：采用SGE protecol C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm)色谱柱，以乙腈-0.03 mol/L醋酸铵溶液(1:4, v/v)为流动相，其中醋酸铵溶液中含有三乙胺(0.02%)，四氢呋喃(0.3%)，加入乙酸调pH = 6，检测波长为216 nm，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL。结果：洋金花中莨菪碱的浓度在62.5 μg/mL~1000 μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系，相关系数R = 0.998，该方法显著缩短莨菪碱的保留时间，并且精密度、稳定性、重复性的RSD均<2.0%，平均加样回收率为98.97%，RSD为0.39%。结论：本方法准确，重复性好，能够用于洋金花中莨菪碱含量的快速测定。
Abstract:
Objective: A method for the rapid determination of the content of hyoscyamine in Hindu datura was established by high-phase liquid chromatography. Method: SGE protecol C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm) column was used with acetonitrile-0.03 mol/L ammonium acetate solution (1:4, v/v) as mobile phase. Ammonium acetate solution contained triethylamine (0.02%), tetrahydrofuran (0.3%), and adjusted to pH = 6 by adding acetic acid. The detection wavelength was 216 nm, the flow rate was 1.0 mL/min, the column temperature was 30℃, and the injection volume was 20 μL. Results: The concentration of hyoscyamine in the range of 62.5 μg/mL~1000 μg/mL showed a good linear relationship with the peak area, and the correlation coefficient was R = 0.998. The method signifi-cantly shortened the retention time of hyoscyamine, and the RSD of precision, stability and repea-tability were all <2.0%, the average recovery rate was 98.97%, and the RSD was 0.39%. Conclusion: The method is accurate and reproducible, and can be used for rapid determination of the content of hyoscyamine in Hindu datura.
1. 引言
洋金花为茄科植物白花曼陀罗(Datura metel L.)的干燥花，又名曼陀罗花、闹洋金等 [1] 。现代医学研究表明洋金花具有平喘止咳、解痉止痛等药用价值和功效 [2] ，在中医药学中被广泛应用。莨菪碱，又称天仙子碱，是洋金花中主要的活性成分之一，其结构与东莨菪碱(见图1)极其相似，两者均有解痉、散瞳、抗胆碱、镇痛、镇静等功能 [3] 。
Figure 1. The chemical structures of scopolamine and hyoscyamine
图1. 东莨菪碱与莨菪碱的化学结构式
高效液相色谱法因其分析速度快、高灵敏度等优良特性，在测定目标物质含量方面受到广泛青睐 [4] 。目前的研究中有关莨菪碱的定量测定以HPLC法为主，马相锋等 [5] 对洋金花中莨菪碱含量的测定采用CAPCELL PAK C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.0025 mol/L庚烷磺酸钠)-乙腈(84:16) (调节pH至5.00)为流动相，结果显示，样品中莨菪碱的保留时间较长，约为31.87 min。李岩等 [6] 的研究中，以乙腈-0.1%三氟乙酸水(14:86)为流动相检测天仙子药材中莨菪碱含量，其保留时间也较长，约为21 min。
本研究以乙腈-0.03 mol/L醋酸铵溶液(1:4, v/v)为流动相对洋金花中莨菪碱含量进行测定，结果表明莨菪碱的分离效果较好，其保留时间约为8 min。本方法有效地缩短了分析时间，为洋金花的质量控制提供科学依据。
2. 仪器与材料
主要仪器：高相液相色谱仪(Agilent1260，美国安捷伦公司)，中药粉碎机(ML-800，苏州摩菱机械设备有限公司)，真空干燥箱(DZF-6050，上海一恒科学仪器有限公司)。
主要材料：洋金花(安徽德信佳生物医药有限公司洋金花种植基地)；莨菪碱标准品(纯度 > 98%，由安徽德信佳生物医药有限公司提供)；除乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。
3. 试验方法
3.1. 色谱条件
流动相为乙腈-30 mmol/L醋酸铵溶液(含0.02%三乙胺，0.3%四氢呋喃，用冰醋酸调节pH值至6.0) (1/4, V/V)，检测波长为216 nm，色谱柱：SGE protocol C18 (5 μm, 4.6 × 250 mm)，流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量20 μL [7] 。
3.2. 样品溶液的制备
精密称取从洋金花中提取的莨菪碱0.1 g于50 mL容量瓶中，加色谱级甲醇定容至刻度，摇匀，精密量取1 mL溶液于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，即得供试品溶液。
3.3. 标准品溶液的制备
精密称取25 mg莨菪碱标准品至25 mL容量瓶中，用色谱级乙腈定容，震荡摇匀直到全部溶解，即得1000 μg/mL的莨菪碱标准品溶液。
3.4. 线性关系考察
以1000 μg/mL的莨菪碱标准液贮备液为母液，进行等倍梯度稀释，得到质量浓度分别为1000 μg/mL，500 μg/mL，250 μg/mL，125μg /mL，62.5 μg/mL的莨菪碱标准溶液。经0.45 μm微孔滤膜处理后，依照上述色谱条件依次进样，以峰面积值Y为纵坐标，以质量浓度值X为横坐标，绘制标准曲线，得到莨菪碱标准品的线性回归方程。
3.5. 精密度实验
精密量取3.3项下莨菪碱质量浓度为250 μg/mL的标准品溶液，按照上述色谱条件连续进样6次，每次进样20 μL。计算峰面积的RSD值。
3.6. 稳定性试验
精密称取1 g干燥的洋金花干粉，按3.2项下的方法制备样品溶液，分别在室温下放置0 h，3 h，6 h，12 h，24 h后，在上述色谱条件下依次进样检测，每次进样20 μL。计算样品溶液中莨菪碱的含量并求RSD值。
3.7. 重复性试验
精密称取6份1 g干燥的洋金花干粉，按3.2项下的方法制备样品溶液，在上述色谱条件下依次进样检测，每次进样20 μL。计算样品溶液中莨菪碱的含量并求RSD值。
3.8. 加样回收率试验
精密称取6份1 g干燥的洋金花干粉，按3.2项下的方法制备样品溶液，测定每份中莨菪碱的含量，然后在每份样品中分别加入适量的莨菪碱标准品(将标准品配制成一定浓度溶液，按照添加量加入合适的体积)，按照上述色谱条件依次进样检测，每次进样20 μL。计算样品溶液中莨菪碱的含量并求RSD值。
4. 实验结果
4.1. 莨菪碱标准曲线
按照上述色谱条件，分别测定各个浓度下的标准品溶液，将所得数据分析处理，绘制出如图2所示的莨菪碱标准曲线，其线性回归方程：Y = 16.618 X − 19.799，R2 = 0.9996。
由图2可知，莨菪碱在62.5 μg/mL~1000 μg/mL范围内具有良好的线性关系。在此色谱条件下莨菪碱的出峰时间约为8 min，拖尾因子T = 0.981，峰形良好。莨菪碱标准品色谱图如图3所示。
Figure 2. Standard curve of hyoscyamine
图2. 莨菪碱标准曲线图
Figure 3. Standard chromatogram of hyoscyamine
图3. 莨菪碱标准色谱图
4.2. 精密度、稳定性、重复性、加样回收试验结果
在精密度试验中莨菪碱峰面积的RSD值为0.50%，表明仪器精密度良好；在稳定性试验中莨菪碱含量的RSD值为1.82%，表明样品溶液在24 h内稳定；在重复性试验中莨菪碱含量的RSD值为1.93%，表明该方法重复性良好；加样回收试验结果见表1，莨菪碱回收率为98.97%，RSD为0.39% (n = 6)，表明回收率满足测定要求。
Table 1. Results of recovery rate of hyoscyamine
表1. 莨菪碱的加样回收率考察结果
5. 结论
本研究基于高相液相色谱法建立一种快速测定洋金花中莨菪碱含量的方法，并通过方法学验证，实验结果表明，莨菪碱的保留时间约为8 min，其分离效果良好，精密度、稳定性、重复性和回收率均符合要求，可用于洋金花中莨菪碱含量的快速测定。
基金项目
2016年安徽省科技重大专项项目(16030801111)。
参考文献