1. 引言
川芎茶调丸为常用中成药，主要由川芎、白芷、羌活、细辛、防风等八味中药组成，具有疏风止痛的功能，临床用于风邪头痛，或有恶寒，发热，鼻塞等症具有很好的疗效。川芎茶调丸的质量控制常以阿魏酸、欧前胡素和异欧前胡素 [1] [2] 为指标，难以真正反映该药的量效关系。方中防风具有祛风解表，胜湿止痛，止痉的功效，所含有效成份升麻素苷与5-O-甲基维斯阿米醇苷等色原酮类化合物具有明显的止痛、抗炎、解热等药理作用，这与川芎茶调丸的功能主治相一致。本文采用高效液相色谱法建立了川芎茶调丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定方法，为进一步控制该制剂质量提供可靠的科学依据。
2. 仪器与试药
2.1. 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；“XS205”电子天平(Mettler toledo公司)。B3200S-T型超声波清洗器(上海必能信超声有限公司)，MILLI Q超纯水纯化系统。
2.2. 试药
升麻素苷对照品(中国药品生物制品检定院，批号：111522-201511)；5-O-甲基维斯阿米醇苷(中国药品生物制品检定院，批号111523-201509)；川芎茶调丸(兰州佛慈制药股份有限公司，批号：17F7、17C3、17D9；兰州太宝制药有限公司，批号：53140101、53140207、53140301)。甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
3. 方法与结果
3.1. 色谱条件
色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 (250 × 4.6 mm, 5 μm)；梯度洗脱条件：0~8 min，乙腈–水 (12:88)；8~10 min，乙腈–水(30:70)；流速：1.0 mL/min；检测波长：302 nm。
3.2. 对照品溶液的制备
精密称取升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL中含99.6 µg、142.8 µg的溶液，即得。
3.3. 供试品溶液制备
取本品细粉约5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇约50 mL，回流提取4小时，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，用0.46 µm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
3.4. 阴性对照溶液的制备
依《中国药典2015年版一部》川芎茶调丸项下，取1/10处方量，按制备工艺配制不含防风的阴性供试品，再按照供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液，即得。
3.5. 方法学研究
3.5.1. 系统适用性实验
精密吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性对照溶液各10 µl，按照“2.1”项下色谱条件测定，结果表明阴性对照溶液在各对照品色谱峰相应的位置处无杂质峰干扰。供试品色谱图中升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷与其他组分分离度均大于1.5，分离良好，理论塔板数按升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷峰计均大于5000，符合《中国药典》2015年版一部附录的有关要求。见图1。
3.5.2. 线性关系
取升麻素苷对照品溶液(99.6 µg/mL)、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液(浓度142.8 µg/mL)，分别精密吸取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL，注入液相色谱仪，按照“2.1”项下色谱条件进行测定，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，计算回归方程，结果见表1。
Figure 1. HPLC chromatograms. (A, standard; B, sample; C, Negative Control. (1. prim-O-glucosylcimifugin; 2. 5-O-methylvisammioside))
图1. 高效液相色谱图。(A对照品；B供试品；C阴性对照。(1. 升麻素苷；2. 5-O-甲基维斯阿米醇苷))
Table 1. Results of working curve
表1. 工作曲线考察结果
3.5.3. 精密度试验
分别精密吸取升麻素苷对照品溶液、5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品溶液各5.0 μL，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，测定升麻素苷，5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积，峰面积的RSD分别为0.61%、0.82%。表明仪器精密度良好。
3.5.4. 稳定性试验
取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷峰面积，结果各成分峰面积的RSD分别为0.93%和1.07%，表明供试品溶液在24小时内稳定。
3.5.5. 重复性试验
取同一批样品(兰州佛慈制药股份有限公司 批号：17C3) 6份，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样测定，计算平均含量，结果升麻素苷为0.0931 mg/g，RSD为2.27%；5-O-甲基维斯阿米醇苷为0.1224 mg/g，RSD为1.31%。表明方法重现性好，符合定量标准要求。
3.5.6. 加样回收率试验
取同一批样品(兰州佛慈制药股份有限公司，批号：17C3) 6份，分别加入升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷各适量，按“2.3”项下供试品溶液制备方法处理并测定，计算各成分平均回收率，结果见表2，表明本方法准确可靠。
Table 2. Results of recovery tests
表2. 加样回收率测定结果
3.5.7. 样品测定
按“2.3”项下方法，对2个厂家6批样品依法制备供试品溶液，进样测定，计算各成分含量，结果见表3。
Table 3. Results of contents determination of samples (n = 2)
表3. 样品含量测定结果(n = 2)
4. 讨论
4.1. 检测波长的选择
《中国药典》2015年版一部中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的测定，检测波长多采用254 nm和290 nm，实验中发现供试品溶液在这两个波长处杂质峰较多，且对主峰测定有干扰，经过紫外光谱测定，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷均在302 nm处有次最大吸收，以302 nm为测定波长，峰形较好，杂质干扰小，因此选择302 nm作为测定波长。
4.2. 流动相的选择
文献报导升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量测定流动相多采用不同比例的甲醇–水、乙腈−0.05%磷酸、乙腈–甲醇–水 [3] [4] [5] [6] ，实验发现采用乙腈–水为溶剂进行梯度洗脱，在本文条件下升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷能与其它成分峰达到基线分离，且峰形对称良好。
5. 结论
本实验采用HPLC法同时测定川芎茶调丸中升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量。实验结果表明该法准确、灵敏，重现性好，结果可靠，为有效控制川芎茶调丸的质量供了方法依据。
基金项目
中央高校基本科研业务费专项资金项目(No. 31920160049, No. 31920190013, No. 31920190018)。