1. 引言
海稻86是陈日胜先生在1986年发现的特殊水稻种质资源，具有较强的耐盐碱能力 [1] 。目前我国的盐碱地面积有1亿公顷 [2] ，这些土地的生产潜力是十分巨大的，人们也在寻找和探索各种利用盐碱地的方式，而种植海水稻就是其中一个重要方向。海水稻的研究近年已成为水稻育种行业的热点，推广海水稻的种植对我国粮食生产和粮食安全具有重要的现实意义。海水稻原始材料海稻86具有很长的芒，这在生产中是极为不利的。湖北大学多倍体遗传实验室在种植的海稻86群体中偶然发现1株无芒株，该植株除无芒外其余性状均与海稻86相同，收获其种子种植后，发现其无芒性状能够稳定遗传，因此该无芒株应为海稻86的无芒突变体，本研究中将其称为“无芒海稻86”。这为海水稻芒性状的遗传规律及基因定位和功能分析提供了极好的材料。本研究通过有性杂交获得了海稻86与无芒海稻86的正、反交种，对杂种及其亲本的主要农艺性状进行了比较，详细分析了杂种及有芒亲本海稻86芒的类型及分布规律，通过F2群体的性状分离情况，分析了海稻86芒的遗传方式。研究结果为海水稻芒基因的定位、克隆和功能分析奠定了基础，同时无芒海稻86也是耐盐碱无芒水稻新品种选育的好材料。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
海稻86、无芒海稻86。海稻86由湖北荆楚种业股份有限公司提供；湖北大学多倍体遗传实验室在种植的海稻86群体中发现1株无芒突变体，称其为“无芒海稻86”。
2.2. 材料种植及杂交
2017年夏季在武汉种植海稻86、无芒海稻86。开花时期以海稻86和无芒海稻86为亲本，进行有性杂交。方法按照闵绍楷等 [3] 进行。杂交获得海稻86/无芒海稻86 F1、无芒海稻86/海稻86 F1，分别简称为F1a和F1b。
2.3. 农艺性状统计分析
2017年冬季在海南陵水种植亲本及F1。待种子成熟后，对亲本及杂种的主要农艺性状进行测量统计，主要包括株高、株穗数、穗长、粒长、粒宽、总粒数、实粒数、结实率等。记载方法参照盖钧镒 [4] “水稻主要育种性状的记载方法和标准”。
2.4. 芒性状的统计分析
观察杂交亲本及F1芒性状的类型，并测量统计具体数据，方法参照Song等 [5] 。按枝梗从上到下依次逐个测量每个籽粒芒的长度，每种材料测量5穗。用I1，I2，I3……分别表示从上到下的一次枝梗，II1，II2，II3……分别表示从上到下的二次枝梗。测量后对整穗芒的最大值、最小值和平均值，一次枝梗及二次枝梗上芒的平均值，芒粒率(有芒籽粒与全部籽粒的百分比)及芒的分布特点等进行分析。
芒粒率(%) = (有芒籽粒数 ÷ 籽粒总数) × 100%
2.5. F2芒性状分离统计分析
F1a和F1b自交后分别获得F2a和F2b种子。2018年夏季在武汉种植F2种子获得F2群体，统计F2群体芒性状的分离情况，并进行c2测验，分析芒基因的遗传方式。
2.6. 数据分析
数据分析采用SPSS 15.0软件(SPSS, Chicago, IL, USA)和Microsoft Excel 2013软件完成。
3. 结果与分析
3.1. 杂种F1的获得
2017年夏季在武汉进行海稻86及无芒海稻86之间的杂交。其中获得F1a (海稻86/无芒海稻86 F1)种子82粒，获得F1b (无芒海稻86/海稻86 F1)种子160粒。
3.2. 杂种及亲本的农艺性状
2017年冬季在海南陵水种植杂种及亲本，成熟后进行主要农艺性状考察。由表1数据可见，正、反交杂种F1a、F1b在主要农艺性状上无明显差异。杂种与两亲本相比，除株穗数外，其余农艺性状与亲本也无明显差异。无芒海稻86穗长较其他材料长，总粒数也多于其他材料。海稻86植株很高，在武汉种植时可超过160 cm。在海南陵水种植时株高约150 cm，又因其茎秆较细，导致抗倒伏能力差，特别是抽穗后特易倒伏；无芒海稻86及杂种也都有相同表现。
3.3. 杂种F1芒性状的表现
根据整个稻穗芒的情况，芒性状可以分成三类：无芒型(全部籽粒无芒)、全芒型(全部籽粒有芒)和顶芒型(部分籽粒有芒) [5] 。本实验中的两个杂交亲本海稻86和无芒海稻86分别表现为全芒型和无芒型(图1)。而二者的杂种，不论是正交杂种F1a还是反交杂种F1b，均表现顶芒型(图1)。正、反交杂种既不是表现海稻86的全芒性状，也不是表现无芒海稻86的无芒性状，而表现为双亲的中间性状(顶芒型)，因此控制海稻86芒性状的基因表现为不完全显性；同时由于正、反交杂种性状表现一致，可知该基因为核基因而非细胞质基因。
Figure 1. The panicles of hybrids and parents. From light to right: Haidao86, F1a, F1b, Awnless Haidao86
图1. 杂种及其亲本的稻穗比较。从左至右：海稻86、F1a、F1b、无芒海稻86
3.4. 杂种及有芒亲本芒的分布特点
通过对有芒亲本海稻86及杂种F1a、F1b稻穗上每个籽粒芒长的详细统计，发现芒的分布具有一定规律性。海稻86为全芒型，每个籽粒上都有芒，但芒的长度不同。就一次枝梗而言，顶端第一个籽粒的芒较长，而第二个籽粒的芒最短，然后向下又逐渐增长，到最后一个籽粒时，芒的长度与第一个籽粒相当甚至超过第一个籽粒。二次枝梗上芒的分布与一次枝梗相似，每个二次枝梗顶端籽粒的芒最长，第二个籽粒的芒最短，然后向下逐渐增长，但由于每个二次枝梗上一般只有3~4个籽粒，所以下部的芒长一般不会超过最顶端的芒长。对每个一次枝梗上的全部二次枝梗而言，芒的变化则呈现向穗轴靠近时逐渐缩短的趋势(图2(a))。
杂种F1a、F1b均为顶芒型，即只有部分籽粒有芒，而且芒仅分布于一次枝梗及二次枝梗顶端的籽粒，而靠近穗轴的籽粒多无芒，所以称为顶芒型。虽然杂种只有部分籽粒有芒，但其变化规律与全芒型亲本海稻86是一致的，一次枝梗也是顶端籽粒的芒较长，第二个籽粒的芒最短，然后向下又逐渐增长；二次枝梗一般只有顶端一个籽粒有芒，其余籽粒无芒或具有很短的芒(图2(b)、图2(c))。不管是全芒型还是顶芒型，总体来看，同一枝梗上一次枝梗籽粒芒的长度都大于二次枝梗籽粒芒的长度。
(a) (b) (c)
Figure 2. The distribution characteristics of awns in hybrids and parents. (a) Haidao86; (b) F1a; (c) F1b. (Grains are arranged according to their inserted order on the branches; I and II represent primary and secondary branches, respectively. 1, 2, 3 represent the order of secondary branches from top to bottom, Bars = 1 cm)
图2. 杂种及有芒亲本芒的分布特点。(a) 海稻86；(b) F1a；(c) F1b。注：图中籽粒取自同一枝梗，从左至右代表籽粒从上到下的着生顺序；I、II分别代表一次枝梗和二次枝梗，1、2、3代表二次枝梗顺序(从上到下) Bars = 1 cm
如综合幼穗颖花的发育，还发现芒的长度与颖花的分化顺序密切相关。颖花分化的顺序对整穗来说是从上至下的，但在每个一次或二次枝梗上，颖花分化呈现独特性，即首先顶端第一朵颖花分化，接着是最基部的那朵颖花分化，然后按从下至上的顺序分化，顶端下的第二朵颖花最后分化 [6] 。对比上述芒长度的分布规律，可见芒的长度与颖花的分化顺序高度吻合，颖花分化越早，芒就越长。
通过表2列出的具体数据则更加清晰地反映上述芒的分布规律。海稻86、F1a、F1b一次枝梗芒长度均明显大于二次枝梗芒长度；对于顶芒型的F1a、F1b一次枝梗的芒粒率则明显大于二次枝梗的芒粒率，说明芒主要分布于一次枝梗的籽粒上，二次枝梗的籽粒较少有芒。亲本海稻86与杂种相比，海稻86的穗芒长、一次枝梗芒长、二次枝梗芒长均显著大于F1a、F1b，而F1a、F1b二者的数据相近，性状表现一致，再次说明海水稻芒的性状是由核基因控制。
Table 2. The distribution characteristics of awns in hybrids and parents
表2. 杂种及有芒亲本芒的分布特点
另外，对芒的长度分布概率进行统计时也发现一定的规律(表3)。对全芒型亲本海稻86来说，随着芒长度的增加，其分布概率基本呈现由少变多再变少的变化规律，符合正态分布；而顶芒型的F1a、F1b则表现出分布概率随着芒长度的增加而逐渐减少的趋势，而且大部分芒的长度都处于0~1 cm之间，比率分别达到67.01%和63.17%。海稻86与杂种相比，芒长度分布范围更广。
Table 3. The distribution probability of awn length on a panicle
表3. 同一稻穗上芒长度分布概率
3.5. 杂种F2芒性状的分离及遗传分析
杂种F2群体植株出现性状分离，共有3种表型：全芒型、顶芒型和无芒型，具体数据如表4所示。其中F2a共统计476株，全芒型、顶芒型和无芒型分别为122、242和112株；F2b共统计486株，全芒型、顶芒型和无芒型分别为111、259和116株。根据孟德尔遗传定律，3种性状的分离比应为1:2:1，通过c2测验，二者P值均大于0.05，都符合预期分离比(表4)，说明海稻86芒的性状受1对等位基因控制。
Table 4. The genetic analysis of F2 population
表4. F2群体遗传分析
4. 讨论
4.1. 从芒的表现看海稻86的起源
水稻颖花外颖先端尖锐，称为颖尖(或稃尖)，有些稻种或品种外颖中脉延伸则形成“芒”(awn)。芒是野生稻普遍存在的典型性状 [7] ，在已知的20多个野生稻种中，除疣粒野生稻(Oryza meyeriana Baill.)、颗粒野生稻(O. granulate Nees et Arn. ex Watt)和极短粒野生稻(O. schlechteri Pilger)外都有芒 [8] 。芒可以防止鸟兽对种子的吞食，并有助于种子的传播，是长期自然选择的结果 [9] [10] [11] [12] 。而在栽培稻中芒则成为收割和加工的不利性状，经过人类有意识的淘汰，现在绝大多数栽培稻都是无芒品种 [12] [13] [14] 。海稻86由陈日胜先生最早发现，由于海稻86具有很长的芒，与野生稻性状相似，所以很多学者认为海稻86属于野生稻类型。但通过我们近年的杂交实验及芒的研究发现，海水稻仍属栽培稻类型，但可能具有野生稻的血缘。首先，海稻86与多个栽培稻品种的有性杂交并未出现栽野杂交中存在的生殖隔离现象，杂交前后不需任何人为促进结实的处理即可正常结实，而且杂种正常可育，说明海稻86为栽培稻类型，而且为籼稻类型，这与杨军等 [1] 在分子水平上的鉴定结果是一致的。Song等 [5] 对芒的分布概率进行详细统计时发现，全芒型栽培稻芒长度的分布都呈现出随着长度的增加分布概率逐渐减少的趋势，而栽野杂交后代则表现出随着芒长度的增加，分布概率由少变多再变少的变化规律。本研究中海稻86芒长度的分布也呈现出与栽野杂交后代相同的变化规律，据此推测海稻86可能是栽培稻与野生稻自然杂交后经过长期进化形成的具有野生稻血缘的栽培稻类型。这可以通过分子生物学及基因组测序等方法加以验证。
4.2. 水稻芒的相关研究
水稻芒的遗传极其复杂，控制芒的基因在12条染色体上都有分布 [15] ，而且基因间还存在互作现象 [16] [17] 。以往研究中，由于研究材料不同而得出了不同的结论。Chao (赵连芳) [18] 通过有芒品种与无芒品种杂交发现，F1为有芒，F2可以分为四种类型，即有芒、大部分有芒、少数有芒和完全无芒，这四种类型的分离比例为12:1:2:1。Kuang (管相桓)等 [19] 关于芒的5种杂交组合(其中一组父母本均无芒)中，F1均为有芒，但F2出现9:7，15:1和3:1三种不同的分离比。其他研究中，还出现9:6:1和63:1的分离比例 [20] 。这充分说明控制芒的基因众多而且基因之间还存在复杂的相互作用。
邵游等 [21] 在野生稻与栽培稻杂交后代的性状遗传规律研究中发现，长芒野生稻与栽培稻的杂种F1表现野生稻性状，在F2中出现全芒、部分有芒和无芒分离。F2中有芒(含全芒和部分有芒)和无芒的分离比率，其中以广东野生稻为父本的1个组合，后代分离比为15:1，另外以东乡野生稻为父本的4个组合，后代分离比均为13:3，即栽野F2芒的分离都符合2对基因遗传规律，广东野生稻表现为2对基因完全显性，东乡野生稻表现为2对基因存在抑制互作。本研究发现海稻86与无芒海稻86 F2群体中，全芒型、顶芒型和无芒型3种类型的分离比分别为1:2:1，如果将全芒型和顶芒型一起归为有芒型，则比例为3:1。说明海稻86芒的性状由1对等位基因控制，且表现为不完全显性。
如此丰富的遗传现象，充分说明关于芒的基因之多，而且有些基因可能还存在多效性、兼性作用等，使芒的遗传更加复杂。另外研究还表明，某些材料还容易受到环境条件的影响，比如光照、温度、海拔高度等都可能造成具有相同基因型的材料而芒性表现不同，这无疑又增加了芒遗传的复杂性和研究的困难性。
在Kinoshito等(1991)的水稻连锁图上，关于芒的基因有4个，即An1~An4。其中An1位于第4染色体上，与d-ll (信金爱国或农林-28矮生)基因连锁交换率为5.4%。An2位于第5条染色体上，与gl-1基因连锁交换率为33%。An3位于第3条染色体上，与bc-1 (脆茎-1)基因连锁交换率为38%。An4位于第8条染色体，与TR7-8b的连锁交换率为5.0%。朱立煌等 [22] 利用水稻DH群体构建了包含444个位点的水稻分子连锁图谱，覆盖水稻基因组1962 cM。基于上述DH群体及其分子连锁图谱，定位了一些重要的质量性状和数量性状基因座位，其中含有两个芒基因An-5与An-10，分别位于第5条、第10条染色体上。近年来，科研人员进一步鉴定到一些与水稻芒性状相关的基因，有些基因已被成功克隆。Kubo等 [23] 、Cai等 [24] 、Matsushita等 [25] 和Thomson等 [26] 利用不同材料定位了18个与芒相关的QTL，分布于水稻除第2号染色体外的所有染色体上。2013年Luo等 [27] 从普通野生稻中分离了一个长芒基因An-1，这是水稻中第一个被克隆的长芒基因。2015年Hua等 [28] 和Gu等 [29] 分别克隆了两个长芒基因——LABA1和An-2。2016年Jin等 [30] 从野生稻中分离出一个长芒基因GAD1。2018年杨德卫等 [31] 定位和克隆了长芒基因GAD1-2，并认为GAD1-2与GAD1为等位基因。相对于已报道研究中用两个遗传背景差异大的材料相互杂交、构建近等基因系或染色体片段置换系等再进行基因定位和克隆的方法，利用本研究中发现的与海稻86遗传背景一致的无芒突变体则能更加容易地定位和克隆相关基因。后续研究将以F2群体中全芒型和无芒型植株为材料，通过基因组测序及图位克隆的方法定位和克隆相关基因。
5. 结论
本研究通过有性杂交获得了海稻86及其无芒突变体的正、反交杂种，对杂种及亲本的主要农艺性状、芒的特点进行了详细比较，通过F1的性状表现及F2群体的分离情况，分析了芒的遗传方式。结果表明杂种及亲本在主要农艺性状上无明显差异；在芒性状表现上，海稻86为全芒型，而正反交杂种均表现为顶芒型；但不论全芒型还是顶芒型，芒的分布都具有一定的规律性。F2群体分离出全芒型、顶芒型和无芒型3种表型，c2测验结果符合预期1:2:1分离比。说明海稻86芒的性状由1对核基因控制，且为不完全显性。研究结果为海水稻芒基因的定位、克隆和功能分析奠定基础；同时无芒海稻86也是耐盐碱无芒水稻新品种选育的好材料。
致谢
感谢湖北荆楚种业股份有限公司段洪波先生提供海稻86种质资源。
基金项目
本研究由1) 国家自然科学基金项目(31571639)；2) 武汉市品牌农业发展计划项目资助。
NOTES
*通讯作者。