灵菌红素的纯化制备工艺研究

The Study on the Preparation and Purification of Prodigiosin

摘要: 通过微生物发酵法生产灵菌红素，薄层层析法筛选合适的灵菌红素展开剂，然后利用硅胶柱层析高效纯化制备灵菌红素纯品，高效液相色谱法检测各纯化组分中灵菌红素的含量。结果发现，微生物发酵法生产灵菌红素粗产品达到6.23 ± 1.56 g/L，其含量为0.29% ± 0.14%；丙酮提取物达到52.3 ± 4.5 mg/L，其含量为29.6% ± 4.8%；以氯仿与乙酸乙酯为基础筛选出9:1比例的灵菌红素与杂质的分离效果较好，适合作为硅胶柱层析的洗脱剂进行灵菌红素的纯化，纯化后的产品经过乙醚洗涤结晶后，产量达到3.3 ± 0.4 mg/L，其含量为96.2 ± 1.3%。

Abstract: In this work, prodigiosin from microbial was purified by silica gel column chromatography, and suitable eluents for prodigiosin were screened by TLC. The content of prodigiosin in different pu-rified steps was determined by high performance liquid chromatography. The results showed that the crude product of prodigiosin produced by microbial fermentation reached 6.23 ± 1.56 g/L with the content of 0.29% ± 0.14%; the acetone extract reached 52.3 ± 4.5 mg/L with the content of 29.6% ± 4.8%; the ratio of suitable eluent was 9:1 (chloroform and ethyl acetate). The final content of prodigiosin could reach 96.2% ± 1.3% and its yield was 3.3 ± 0.4 mg/L.

1. 引言

灵菌红素是一种主要由微生物产的天然红色素，1929年Amako等在研究沙雷氏菌（Serratia）生长时发现，而首先分离得到灵菌红素的是Harashima等在1960年完成的 [1] [2] ，其化学结构式如图1所示。

Figure 1. Chemical structure of prodigiosin

图1. 灵菌红素的化学结构式

随着研究人员对灵菌红素的性质及生物活性的深入研究，发现它具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物 [3] [4] [5] ，以及人们最关注的免疫抑制活性和引起肿瘤细胞凋亡的作用 [6] [7] [8] ，因此作为一种天然色素，灵菌红素在医学、食品、印染、纺织、饲料添加剂、环境治理等领域，均有巨大的应用潜力和广阔的市场前景。且灵菌红素作为一种微生物所产的色素，克服了植物色素提取的诸多弊端，如生产周期短，同时不受资源、时间和空间等因素的限制，并且易于工业化生产 [9] [10] [11] 。为此，本文利用实验室筛选的一株高产菌株进行发酵生产灵菌红素，研究其纯化制备方法为灵菌红素的进一步开发利用提供大量的物质基础。

2. 材料与方法

2.1. 灵菌红素的发酵

利用本实验室分离鉴定的粘质沙雷氏菌(CGMCC:4074)按照文献 [12] 所述条件进行种子培养与发酵培养，培养48 h后，5000 rpm离心收集菌体，60℃真空干燥，称重，得灵菌红素粗产品。

2.2. 灵菌红素的提取

称取适量灵菌红素粗产品加入按照1:27 (W:V) pH = 3.0的酸性丙酮，25℃下，超声提取20 min，提取3次。合并提取液于60℃旋转蒸干得到丙酮提取物，称重。

2.3. 灵菌红素的薄层层析

以自制的硅胶G60薄层层析板为层析介质，使用氯仿:乙酸乙酯的双溶剂系统，分别筛选1:9，3:7，5:5，7:3，9:1五种展开剂，分析杂质与灵菌红素的分离度与R_f值变化，确定最优展开剂。

2.4. 灵菌红素的硅胶柱层析

采用湿法柱层析的方法进行灵菌红素的硅胶柱层析。使用普通玻璃层析柱(10 mm × 20 cm)，按照样品与柱层析硅胶(200~300目) 1:10的质量比进行加样，按照2.3优化的展开剂进行等度洗脱，根据颜色变化，收集灵菌红素部分，于60℃旋转蒸干，乙醚洗涤后得到柱层析纯化物，称重。

2.5. 灵菌红素的含量检测

通过高效液相色谱外标法测定各组分灵菌红素的含量。供试品溶液的制备：精密灵菌红素粗产品、丙酮提取物和柱层析纯化物10 mg使用色谱甲醇超声波提取，离心并定容至25 mL备用。对照品溶液的制备：精密称取灵菌红素对照品1.0 mg使用色谱甲醇超声波溶解并定容至25 mL容量瓶中，制成40 mg/L的灵菌红素对照品溶液，备用。色谱条件为：使用Agilent Technologies 1200液相色谱仪，Agilent Zorbax SB-C₁₈ (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱，在甲醇：5%乙酸铵 = 85:15的流动相系统，535 nm检测波长下，以1.0 mL/min流速，测定灵菌红素含量。

3. 结果与分析

3.1. 灵菌红素的发酵与提取实验结果

通过上述的发酵过程，结果获得了6.23 ± 1.56 g/L的灵菌红素粗产品。对粗产物进行丙酮超声波提取后获得52.3 ± 4.5 mg/L丙酮提取物。经过硅胶柱层析后获得3.3 ± 0.4 mg/L。

3.2. 灵菌红素的薄层层析条件筛选结果

在溶剂比例条件下，灵菌红素与杂质的分离效果差异明显。其中，根据经验得知，当展开剂使目标产物与杂质的R_f值差异在0.5以上，其作为柱色谱的洗脱剂，对其分离效果较好(如图2与表1所示)。因此，溶剂系统选择氯仿:乙酸乙酯 = 9:1为最优洗脱剂。

Table 1. Rf changes of prodigiosin and impurities in different solvent ratios

表1. 不同溶剂比例条件下灵菌红素与杂质的Rf变化

3.3. 灵菌红素的含量检测结果

在不同处理条件下所获得的灵菌红素产品，通过高效液相色谱外标法测定了灵菌红素含量，结果见表2与图3。从表2可以看出，灵菌红素粗产品中灵菌红素含量较低，大多数是菌体的重量，丙酮提取

Figure 2. Thin layer chromatography of prodigiosin

图2. 灵菌红素TLC图

以后灵菌红素的含量提高100倍左右，而硅胶柱层析又将灵菌红素含量提高了3倍左右，达到了96%以上。但在灵菌红素的回收率上，丙酮一步提取后，其回收率在86%以上，而经过柱层析后其回收率下降到20%以下。这些可能大大增加了灵菌红素的分离纯化成本。

Table 2. Contents of different prodigiosin samples

表2. 不同灵菌红素样品的含量

a柱层析纯化物b丙酮提取物

Figure 3. High performance liquid chromatography of prodigiosin

图3. 灵菌红素的高效液相色谱图

4. 结论

以粘质沙雷氏菌发酵法生产灵菌红素产品是绿色可行的，其粗产品的产量可以达到6.23 ± 1.56 g/L。配以超声波辅助提取技术可以大大提高灵菌红素的含量，达到29.6% ± 4.8%。再经过硅胶柱层析可以高效纯化制备高纯度的灵菌红素纯品，其含量可达到96.2% ± 1.3%。该工艺操作简单、灵活，可根据实际需要进行删减。比如灵菌红素用于水体治理和染色方面，可以直接使用丙酮提取物。对于开发药品或扩展其生物活性，可以使用柱层析纯化产品。因此该纯化制备工艺为进一步开发灵菌红素应用提供一定的参考数据。

基金项目

嘉兴市科技局项目(2016AY13005)资助，2018年嘉兴学院重点SRT项目(85178404)资助。

参考文献

NOTES

*通讯作者