1. 引言
乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来已成为全球女性第二大死因 [1]。2015年，约430万中国妇女诊断患有乳腺癌，其中75%人死于乳腺癌 [2]。乳腺癌治疗包括外科手术切除、化疗、放疗、内分泌治疗、靶向治疗和其他补充治疗 [3]。但是，这些传统治疗方法大多数会产生副作用或疗效不佳。因此，寻找新的靶点抑制乳腺癌生长和诱导其凋亡，可延长乳腺癌患者生存期和改善生活质量。跨膜蛋白176B (Transmembrane protein 176B, TMEM176B)，也称为耐受相关诱导蛋白，是一种免疫调节的阳离子通道 [4] [5]。TMEM176B蛋白包含四个跨膜结构域及C端的ITIM基序。TMEM176B及其同源TMEM176A是MS4A蛋白家族的成员 [6]，主要表达于单核细胞、巨噬细胞和CD11B+树突状细胞 [7]。随后研究发现TMEM176B广泛存在于肺脏、肝脏、肾等 [8]。最近研究发现TMEM176B调控肿瘤微环境中免疫细胞功能，且阻断TMEM176B后增强抗肿瘤免疫作用 [9]。但是，TMEM176B在乳腺癌中表达及其对乳腺癌作用和分子机制尚未清楚。
在这篇文章中，我们探讨TMEM176B在乳腺癌中表达及其在乳腺癌中作用，同时阐明其分子机制。本文采用小分子干扰片段敲低乳腺癌细胞TMEM176B表达，用MTT实验、CCK8实验和流式细胞实验检测乳腺癌生长和凋亡情况。同时检测相关凋亡蛋白Bax\Bcl-2、增殖蛋白Ki67，以及抑癌基因p53和AKT信号通路，初步阐明TMEM176B在乳腺癌癌中作用及分子机制。此外，我们也初步评估TMEM176B在乳腺癌诊断中价值。
2. 材料与方法
2.1. 细胞培养
乳腺癌细胞株MDA-MB-231购自ATCC。用DMEM+10%的胎牛血清完全培养基无菌于37˚、5% CO2的细胞培养箱中培养。
2.2. 试剂和耗材
MTT购自北京鼎国公司。CCK8试剂盒购自乐研生物公司。Real time PCR的SYBER Green和逆转录酶试剂盒购自Takara公司。RNA提取试剂盒购自TIANGEN公司。干扰TMEM176B的siRNA小分子干扰片段购自上海吉玛公司。转染试剂Lipo3000购自Invtrogen公司。细胞培养液购Hyclone公司。TMEM176B抗体购自Proteintech公司；Bax、Bcl-2、p53、Ki67、β-actin抗体购自Abcam公司。
2.3. 方法
MTT法检测乳腺癌细胞活力：采用噻唑兰颜色反应法，即MTT法进行细胞增殖活力的测定。其原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色晶体甲缵，并沉淀在细胞中，而死细胞无此功能。MDA-MB-231细胞种植于96孔板，转染siRNA-TMEM176B，处理24 h后，每孔加入10 µl的MTT工作液(浓度为5 mg/ml)，于37˚、5% CO2的细胞培养箱中继续培养4小时；去掉上清，加入150 µl DMSO，1000转/min，摇床震荡10 min，用酶标仪测定OD490的光密度值。实验中每份样品设6个复孔，实验至少重复3次。
CCK8法检测乳腺癌细胞活力：该试剂中含有WST-8，它在电子载体1-Methoxy PMS的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。每孔接种5000个细胞，设定6个重复孔，细胞贴壁后，转染siRNA-TMEM176B，24 h后加入PBS润洗后吸出，加入稀释好的CCK8溶液，放入培养箱中30 min后测定OD值。
qRT-PCR实验
qRT-PCR检测乳腺癌组织TMEM176B的转录水平。步骤如下：收集20例乳腺癌组织，以癌旁组织为对照组，提取RNA，逆转录为cDNA，用Takara公司的SYBER green试剂盒进行实时荧光PCR实验。PCR条件为：95℃ 30 s，1个循环；PCR反应，95℃ 5 s，60℃ 10 s，40个循环；溶解，95℃ 0 s，65℃ 20 s，95℃ 0 s，1个循环。PCR结束后，根据反应得到的Cp值，使用相对定量的分析方法，以标准曲线进行校正，最后计算出样品中各mRNA的相对浓度。进行qRT-PCR引物序列如表1。
Table 1. The primer of qRT-PCR
表1. 实时荧光定量PCR引物
干扰TMEM176B实验
TMEM176B干扰小分子片段siRAN购自上海吉玛公司。
具体步骤如下：MDA-MB-231细胞种植于六孔板中，待其融合度为50%~60%时候，用Lipo3000转染试剂转染干扰小分子片段siRNA，一定时间后进行MTT实验、CCK8实验和流式细胞实验。
流式细胞实验
MDA-MB-231细胞种植于六孔板中，待其融合度为50%~60%时候，用Lipo3000转染试剂转染干扰小分子片段siRNA，24小时后收集细胞，重悬在1 × binding buffer中，调浓度为1 × 106/ml，加入PI和Annexin V，孵育15 min，流式细胞仪分析。
Western blot实验
收集处理好的乳腺癌细胞蛋白或乳腺癌组织蛋白，进行蛋白定量，跑胶，电转电泳。加入一抗，4度过夜，收集一抗，加入二抗，然后加入ECL显色，拍照。
2.4. 统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示。采用t检验。P < 0.05表示具有统计学意义。
3. 实验结果
3.1. 乳腺癌组织中TMEM176B表达情况
收集诊断为乳腺癌患者的乳腺癌组织，取癌旁组织为对照组。采用实时荧光PCR和Western blot分别检测TMEM176B在乳腺组织中表达。结果显示，相对于癌旁组织，TMEM176B在乳腺癌组织中高表达(图1(A)和图1(B))。
(A) Western blot检测TMEM176B在乳腺癌组织中表达。(B) qRT-PCR检测TMEM176B在乳腺癌组织中表达。**p < 0.01。
Figure 1. The expression of TMEM176B in breast cancer tissue
图1. TMEM176B在乳腺癌组织中表达
3.2. TMEM176B在乳腺癌细胞中作用
用小分子干扰片段siRNA转染MDA-MB-231细胞，进行MTT实验、CCK8实验检测乳腺癌细胞活力，以及流式细胞实验检测乳腺癌细胞凋亡作用。结果显示，小分子干扰片段siRNA敲低乳腺癌细胞TMEM176B后，乳腺癌细胞活力明显受抑制(图2(A)和图2(B))。流式细胞实验结果显示干扰TMEM176B后诱导乳腺癌细胞凋亡(图2(C))。这些结果表明TMEM176B调控乳腺癌细胞的凋亡过程。
3.3. TMEM176B调控乳腺癌细胞相关凋亡蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达
为了阐明TMEM176B调控乳腺癌细胞生长和凋亡作用的分子机制，我们检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达。结果显示，干扰TMEM176B后明显上调促凋亡蛋白Bax表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2表达(图3(A))，明显上调Bax/Bcl-2比例(图3(B))。此外，我们也检测了增殖蛋白Ki67情况。图3(C)显示，沉默TMEM176B后明显下调Ki67蛋白表达。这些结果表明敲低TMEM176B后可能通过调控凋亡蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达进而调控乳腺癌细胞凋亡作用。
(图3(A)和图3(B)) TMEM176B调控乳腺癌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Bax和Bcl-2表达。**p < 0.01。图3(C) TMEM176B调控乳腺癌细胞Ki67蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Ki67表达。
(A和B) MTT和CCK8法检测乳腺癌细胞的活力。干扰TMEM176B后，于24 h、48 h、72 h检测细胞活力。(C) 流式细胞实验检测乳腺癌细胞凋亡情况。干扰TMEM176B后，于24 h检测实验细胞凋亡情况。***p < 0.001。
Figure 2. TMEM176B knockdown inhibits breast cancer viability and promotes apoptosis
图2. 敲低TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡
(A和B) TMEM176B调控乳腺癌细胞Bax和Bcl-2蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Bax和Bcl-2表达。**p < 0.01。(C) TMEM176B调控乳腺癌细胞Ki67蛋白表达。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测Ki67表达。
Figure 3. TMEM176B regulates the expression of Bax/Bcl-2 and Ki67
图3. TMEM176B调控乳腺癌细胞Bax/Bcl-2和Ki67蛋白表达
3.4. TMEM176B调控乳腺癌细胞p53和p-AKT水平
为了进一步阐明TMEM176B调控乳腺癌细胞凋亡作用的分子机制，我们检测抑癌p53蛋白和p-AKT水平。结果显示，干扰TMEM176B后，上调抑癌p53蛋白表达和下调p-AKT水平(图4(A)和图4(B))。以上结果表明，TMEM176B可能通过p53和p-AKT通路调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2和增殖蛋白Ki67表达，进而调控乳腺癌凋亡作用。
3.5. TMEM176B在乳腺癌诊断价值评估
为了评估TMEM176B在乳腺癌诊断中价值，我们进行了ROC曲线分析。结果显示，TMEM176B在乳腺癌诊断中具有较好价值，AUC面积为0.919 (图5(A))。同时ROC曲线分析表明TMEM176B对乳腺癌诊断敏感性和特异性分别为81.5%和89.5%；95%置信区间为0.832~1.005 (图5(B))。
(A和B) 干扰TMEM176B后上调乳腺癌细胞p53蛋白表达和下调p-AKT水平。小分子RNA敲低TMEM176B后，于24 h收集细胞蛋白检测p53蛋白表达和p-AKT水平。
Figure 4. Up-regulation of p53 and p-AKT in breast cancer treated with siRNA for TMEM176B
图4. 干扰TMEM176B后上调乳腺癌细胞p53蛋白表达和下调p-AKT水平
(A和B) ROC曲线分析TMEM176B在乳腺癌诊断中价值。
Figure 5. Evaluation of TMEM176B in the diagnosis of breast cancer
图5. TMEM176B在乳腺癌诊断中评估
4. 讨论
乳腺癌在女性恶性肿瘤中排第一位，虽然近几年治疗水平提高，患者病情得到很好的控制。但是，发生远处转移的患者平均生存率极低(低于24个月) [10]。因此，寻找新的靶点诱导乳腺癌凋亡有望提高乳腺癌患者的生存期。人TMEM176B最初发现于人肺成纤维细胞中 [11]，最近研究发现其与小细胞肺癌有关 [12]。越来越多证据表明TMEM176B与肿瘤发生发展密切相关。TMEM176B蛋白异常积累与癌症的发病机制显著相关 [13]，并且在胃肠道肿瘤中TMEM176B高表达 [14]。但是，TMEM176B在乳腺癌凋亡中作用及分子机制尚未清楚。我们研究发现TMEM176B在乳腺癌中高表达，且敲低TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡。分子机制方面，我们发现TMEM176B调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、增殖蛋白Ki67、抑癌基因p53表达和p-AKT水平。此外，ROC曲线分析表明TMEM176B对乳腺癌诊断有良好价值，可辅助乳腺癌诊断。
细胞凋亡也是肿瘤的一个重要特征 [15]。细胞凋亡主要由细胞凋亡蛋白Bcl-2家族调控。Bcl-2家族包括促凋亡蛋白Bak和Bax以及抑凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1 [16]。我们实验中发现敲低TMEM176B后明显上调促凋亡蛋白Bax水平，下调抑凋亡蛋白Bcl-2水平，明显升高Bax/Bcl-2比例；且功能实验表明阻断TMEM176B后抑制乳腺癌生长和诱导凋亡，表明TMEM176B可能通过调控凋亡蛋白Bcl-2家族调控进而调控乳腺癌凋亡过程。抑癌基因p53作为细胞应激传感器而发挥作用，由DNA损伤和癌基因激活等应激条件激活，在肿瘤凋亡中起着重要作用。正常情况下，p53蛋白水平较低，这是由于p53靶向E3泛素蛋白连接酶mdm2的反馈调节，后者靶向p53进行蛋白酶体介导的降解 [16]。我们实验发现TMEM176B也可调控p53蛋白表达。PI3K-Akt信号通路在乳腺癌的发展中起着重要作用。p-Akt作为这一途径中最关键的信号分子，作为一种治疗靶点引起了广泛的关注 [17]。在我们实验中，发现沉默TMEM176B后下调p-Akt，提示TMEM176B也可能作为p-Akt抑制剂成为治疗乳腺癌新的靶点。此外，ROC曲线表明TMEM176B也是乳腺癌诊断的潜在指标。但是，TMEM176B在体内是否调控乳腺癌凋亡过程以及TMEM176B如何调控p53蛋白表达和p-Akt水平尚需进一步研究，这也是本文不足之处。
总之，在这篇论文中我们研究TMEM176B在乳腺癌中作用和初步探讨分子机制，同时分析其在乳腺癌中诊断价值。我们发现阻断TMEM176B后抑制乳腺癌细胞生长和诱导其凋亡，其机制与Bax/Bcl-2、Ki67、抑癌基因p53和p-AKT通路有关，这些结果表明靶向TMEM176B可诱导乳腺癌凋亡，为将来临床靶向TMEM176B治疗乳腺癌提供实验基础，具有一定的临床意义。
NOTES
*通讯作者。