1. 引言
链霉菌具有杀菌抑菌活性，通过发酵使其产生活性代谢产物是目前微生物农药开发的一个重要途径 [1] 。
福建柘荣太子参的种植面积及产量居全国之首，产销量占全国三分之二，成为农民收入的最主要来源。近几年，随着栽培年限的延长，太子参生产过程中出现了连作障碍现象，如长势变弱、病害加重、产量下降等问题 [2] [3] 。太子参种植土壤酚酸类自毒物质含量增加，是产生连作障碍原因之一 [4] 。有学者认为连作障碍是由于作物长期连作导致土壤微生物群落受到破坏、多样性水平下降，病原微生物数量增加引起 [5] 。微生物菌肥在农业、中药种植中的应用受到人们广泛关注 [6] [7] 。
太子参叶斑病和太子参根腐病是由真菌引起两种主要的病害，本文考察链霉菌的发酵产物对大叶镰刀菌、子囊菌和木贼镰孢菌等3种太子参种植中常见病原真菌生物活性的影响，为扩大链霉菌发酵产物应用范围、探索微生物菌肥的作用机制奠定基础。
2. 材料和方法
2.1. 仪器
XMT-A7000型隔水式电热培养箱(上海实验仪器总厂)，SW-CJ
-1F
超净工作台（苏州净化设备有限公司），YXQG02电热式蒸汽消毒器(山东新华医疗器械厂)，ZHWY-200D型摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)，移液枪(德国Eppendorf)，DMI8/DFC550型倒置荧光显微镜(德国Leica公司)，VARIOSKAN FLASH全波长扫描式多功能酶标仪(美国Thermo公司)，ExCell biology 96孔板。
2.2. 菌种和培养基
链霉菌(Streptomyces sp.)，大叶镰刀菌或铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)。以上菌种由宁德市南岭农业有限公司提供。
菌株培养基为葡萄糖10.0 g，酵母提取物20.0 g，蛋白胨5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.5 g；蒸馏水1000 ml，调节pH至7.0 ± 0.2。
发酵培养基为黄豆饼粉培养基(黄豆饼粉20 g，葡萄糖20 g，CaCO3 8 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，蒸馏水l000 ml，调节pH 7.2~7.4)。
菌活性测定培养基为PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，蒸馏水1000 ml)，自然pH。
肉汤培养基(北京陆桥有限公司)，一次性营养琼脂平板(规格9 cm，青岛海博生物技术有限公司)。
2.3. 链霉菌发酵产物制备
无菌水洗下培养好的链霉菌孢子，配成孢子悬浮液。250 ml三角瓶中装l00 ml培养基，按体积比1:10将孢子悬浮液加入发酵培养基中，28℃~30℃发酵。96 h后滤去菌丝，冷冻干燥，将得到的干物质用蒸馏水配成一定浓度，备用。
2.4. 链霉菌发酵产物抗菌活性测定
采用菌丝生长速率法 [8] 测定链霉菌株发酵产物对对所选3种植物病原菌的抗菌活性。PDA培养基加热溶化高压灭菌，冷却至50℃；用蒸馏水将准确称量的链霉菌发酵液冻干粉稀释为2个浓度(1000 μg/mL和500 μg/mL)，与灭菌的定量PDA培养基，封盖，放入120 r/min摇床中振荡充分摇匀，并以等体积的蒸馏水加入到PDA培养基中作对照，然后分别倒入直径为90 mm培养皿中冷却，待培养基凝固制成平板。
将培养至对数生长期的大叶镰刀菌、嗜热子囊菌、木贼镰孢菌，以1%接种量(菌体浓度为106个/mL)接种到肉汤培养基中，制备菌饼。
以无菌操作手续，用打孔器在每个培养基中央接入已制备好的供试病原菌菌饼(直径为4 mm)菌丝面向下，每皿等距离放置3个菌种，然后将培养皿置于27℃下恒温箱培养3 d，于接种后不同的时间点，用十字交叉法测量菌落的2个直径，取其平均值作为代表菌落的直径，求出菌丝生长抑制率。抑菌率(%) = [(对照菌落直径 − 给药菌落直径)/对照菌落直径] × 100。
2.5. 菌体DNA和RNA相对含量变化的测定
取链霉菌发酵液高/中/低三种浓度作用0 h，4 h，8 h，12 h，16 h，20 h和24 h的菌体样液(菌体浓度为106个/mL)，加入3倍体积的4',6-二眯基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，振荡10 min使其混匀，然后立即用酶标仪进行荧光检测，DNA和RNA的激发波长分别为364 nm和400 nm，测定三种不同菌种的DNA和RNA DAPI染色的荧光强度，每组重复3次，以等浓度的链霉菌发酵液为空白对照。
2.6. 统计分析
采用SPSS 15.0软件，数据以均值(
)的形式表示，二组间的比较用检验，二个以上组间的比较用ANOVA/Holm-Sidak统计软件处理。以P < 0.05为差异有统计学意义，P < 0.01为有非常显著差异。
3. 结果与讨论
3.1. 链霉菌发酵液对病原菌的抑制作用
在链霉菌发酵液浓度为1000 μg/mL时完全抑制菌丝生长。当供试浓度降为500 μg/mL时，链霉菌发酵液与病原菌共培养24 h后真菌开始繁殖；共培养48 h，与空白对照组相比大叶镰刀菌和木贼镰孢菌的菌落直径减小(P < 0.05)，而子囊菌减小的差异性不显著；共培养72 h，与空白对照组相比大叶镰刀菌和木贼镰孢菌的菌落直径显著减小(P < 0.01)，子囊菌的菌落直径也有所减小(P < 0.05)。见表1。
Table 1. Diameter of bacteriostatic circle of Streptomyces fermentation broth to different strains (n = 3, x ¯ ± s e mm)
表1. 链霉菌发酵液对不同菌种的抑菌圈直径(n = 3,
mm)
注：与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01。
3.2. 链霉菌发酵液对病原菌的核酸含量的影响
空白对照组和1000 μg/mL、500 μg/mL、100 μg/mL三个不同剂量链霉菌发酵液组核酸含量的变化见图1所示，经不同剂量链霉菌发酵液作用的木贼镰孢菌的核酸含量均比对照组降低，当共培养12 h后，DNA和RNA的荧光强度比对照组显著降低，不同剂量链霉菌发酵液组的核酸含量都比对照组低，说明链霉菌发酵液能阻碍木贼镰孢菌核酸的生成；其中高剂量组减少的幅度最大，作用效果比较好。与空白对照组比较，经不同剂量链霉菌发酵液作用不同时间，链霉菌发酵液对大叶镰刀菌和子囊菌的核酸含量没有显著的影响。
Figure 1. Effects of different doses of Streptomyces fermentation solution on the content of DNA (a) and RNA (b) of Fusarium equiseti
图1. 不同剂量链霉菌发酵液对木贼镰孢菌DNA (a)和RNA (b)含量的影响
链霉菌发酵液与病原菌共培养48 h，对大叶镰刀菌和木贼镰孢菌的平均抑制率分别为13.21%和24.49% (P < 0.05)，而对子囊菌的抑制率为6.67%差异性不显著；共培养72 h，对大叶镰刀菌和木贼镰孢菌的平均抑制率分别为30.64%和51.37% (P < 0.01)，对子囊菌的抑制率为12.29 (P < 0.05)。链霉菌发酵液对木贼镰孢菌的抑制作用最强，大叶镰刀菌次之，对子囊菌的抑制作用最弱。
4. 结论
微生物的代谢产物中发现了大量有价值的药物或先导化合物。目前，用于临床的抗生素约有80%来源于链霉菌，其代谢产物为医药工作者提供了大量的研究素材，包括大环内酯类、他汀类，多肽类、氨基香豆素等种类繁多的活性化合物。本课题组成员前期筛选实验中，发现了一株链霉菌，编号为BOR-1227，其单菌落琼脂块具有抑菌活性。发酵液粗提物具有一定的抗血管新生能力，可进一步研究其抗癌活性。
本项目应用链霉菌发酵液的抗菌活性，选择太子参种植过程中可能出现的3类病原菌，考察链霉菌发酵液对大叶镰刀菌、木贼镰孢菌、子囊菌3个菌株的活性抑制率，链霉菌发酵液木贼镰孢菌的抑制作用最强，大叶镰刀菌次之，对子囊菌的抑制作用最弱。DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。当DAPI与DNA结合时，DAPI-DNA分子荧光强度大约会提高20倍；DAPI也能够结合RNA，其荧光强度是DAPI-DNA分子的1/5；根据荧光强度的大小可以确定DNA和RNA的含量。本文研究表明，经链霉菌发酵液作用后木贼镰孢菌核酸含量降低，说明核酸的合成受到阻碍，经链霉菌发酵液可能是通过抑制菌落核酸的合成而达到抑菌效果。但链霉菌发酵液对大叶镰刀菌和子囊菌的核酸含量没有显著的影响。
本研究探索扩大链霉菌发酵产物应用范围、为中药材种植微生物菌肥的开发奠定基础。
基金项目
2016年第一批福建省中青年教师教育科研项目(JAT160231)。
NOTES
*通讯作者。