1. 引言
外界环境对卵生爬行动物的胚胎发育影响极大，温度是其中一个重要的环境因子 [1] 。对乌龟而言，胚胎期的孵化温度可显著影响卵的孵化期、孵化率、孵出幼体表型特征和功能特征等 [2] [3] [4] [5] 。温度依赖性别决定型(Temperature-Dependent Sex Determination, TSD)爬行动物幼体性别受到孵化温度的影响 [6] [7] ，胚胎性别分化的关键期主要集中在温度敏感期(TSP) [8] 。乌龟属于TSD Ia型，即低温孵出后代以雄性为主，高温孵出以雌性为主 [4] 。迄今为止，有关温度对龟鳖动物胚胎发育影响的研究主要侧重于性别分化的现象与机理研究 [4] [9] [10] [11] [12] ，在进行温度置换实验(Temperature-Shift Experiment)时候往往忽略了温度置换对胚胎TSP其他性状的影响。同时，由于全球气候变暖，环境温度变动加剧，孵化过程中孵化温度在胚胎不同发育期的改变将影响到胚胎发育和孵出幼体的性状。
乌龟在中国野外曾经广泛分布，但是由于生态环境的恶化及人为过度的捕捉，乌龟的野生自然资源日益枯竭。同时，在国内外食用、药用和宠物市场的迫切需求下，乌龟的人工养殖却在日趋兴旺。因此，开展温度对乌龟卵孵化和幼体性状的影响研究，不仅能拓展温度对爬行动物胚胎发育影响的认识，而且可以为乌龟的生产养殖提供一定的参考作用。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
实验用乌龟卵购自浙江省海宁龙头阁龟鳖养殖场，均为产出24小时后的受精卵，中部白斑明显。
2.2. 人工孵化
共设置3个恒定的孵化温度：(26 ± 0.5)℃ (产雄温度)、(29 ± 0.5)℃、(31 ± 0.5)℃ (产雌温度)和6个温度置换试验 [11] ，每个温度下入孵龟卵15枚。在胚胎发育第15、18和21期(分别对应TSP早、中和后期)分别将15枚龟卵从雄性产生温度(26℃)下置换到雌性产生温度(31℃) (温度置换实验组I-III)，或者将龟卵从31℃置换到26℃ (温度置换实验组IV-VI)。将卵白斑朝上半埋于内含潮湿基质(−220 kPa，干蛭石：水 = 1:1)的孵化盒中。孵化盒分别置于设定温度为26℃、29℃和31℃的人工气候箱(宁波莱福科技有限公司)，每隔三天补充孵化基质散失的水分，以保持盒内湿度恒定。孵化过程中每周按顺序调整培养箱中的孵化盒位置，以减少箱内温度梯度的可能影响。恒温组同时孵入多余的备用蛋，每隔两天剖蛋观察，以确定乌龟胚胎发育期 [13] [14] 。
2.3. 幼体性状的测定
孵化期为卵入孵时间至幼体破壳时间的间隔。待幼体即将破壳，每天检查孵化盒3次。一旦幼体孵出，立即收集新生幼体测定其体重，两天后测其背甲长、宽和高。
2.4. 数据统计
采用Excel 2013和SPSS 19.0软件对实验所得数据进行统计与处理。应用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验温度对孵化期的影响；以初始卵重为协变量，温度为因子，用协方差分析(ANCOVA)检验温度对稚龟形态特征(稚龟质量、背甲长、背甲宽、体高)的影响。描述性统计值用平均值 ± 标准误表示，显著性水平设置为α = 0.05。
3. 结果
3.1. 温度对孵化期的影响
从总体上来看，温度显著影响幼体的孵化期(F8,89 = 50.863，P < 0.001) (见表1)。在26℃~31℃范围内，胚胎发育速度随孵化温度的升高而加快。其中，温度置换实验I、II、III与26℃相比，孵化期存在显著差异(P < 0.001)，且胚胎发育速率均增快(见表1)。温度置换实验I的发育速率最快，表明在乌龟胚胎发育第15期提高温度，对其孵化期影响最大。同时，温度置换实验I与温度置换实验II相比无显著差异，但是与温度置换实验III相比存在显著差异(P < 0.001)。温度置换实验V、VI与31℃相比，孵化期差异均不显著(P > 0.05)，表明在胚胎发育第18期、第21期适当降低温度，不会对孵化期造成显著影响。但是，温度置换实验IV与31℃间存在显著差异(P < 0.001)，表明在乌龟胚胎发育第15期降低温度，会对乌龟胚胎发育造成显著影响，延长孵化期。综上所述，从TSP的三个时期来看，温度变化对乌龟胚胎发育第15期影响最大。
Table 1. Hatching time and development rate of turtle eggs under different temperatures
表1. 不同温度下龟卵孵化时间和发育速率
注：发育速率即孵化时间的倒数；同一列具有相同的角标字母为差异不显著，不同为差异显著。
3.2. 孵化温度对稚龟形态特征的影响
以初始卵重为协变量，温度为因子，协方差分析检验表明：在26℃~31℃范围内，随着孵化温度的增加，稚龟重量、背甲长、背甲宽、体高均有所减少(见表2)。孵化温度对稚龟重量(F8,88 = 3.774，P < 0.01)、背甲长(F8,88 = 3.987，P < 0.001)、背甲宽(F8,88 = 3.172，P < 0.01)、体高(F8,88 = 5.438，P < 0.001)均有显著影响，处于26℃和31℃下的孵出稚龟重量存在显著差异(P < 0.05)。乌龟卵一直处于26℃孵化与分别在第15期、第18期、第21期挪入31℃相比，稚龟重量、背甲长、背甲宽、体高较高，且均有显著差异(P < 0.05)。但是，温度置换的不同组别之间不存在显著差异。乌龟卵一直处于31℃孵化与第15期挪入26℃相比，稚龟重量较轻，且有显著差异(P < 0.05)，其他时期挪入不会产生显著影响。综上所述，TSP中的温度置换仍然会对稚龟的形态特征产生影响。
Table 2. Morphological indices of hatchling turtles at different incubation temperatures
表2. 不同孵化温度孵出稚龟的形态指标
注：同一列具有相同的角标字母为差异不显著，不同为差异显著。
4. 讨论
4.1. 孵化温度对乌龟卵孵化的影响
孵化温度对爬行动物的胚胎发育过程起着极其重要的影响。前人研究发现，孵化温度显著影响乌龟胚胎的能量利用，在27℃~30℃可提高胚胎能量转化效率，促进胚胎从卵黄和卵壳中吸收较多的矿物质，有利于孵出发育良好的幼体 [3] 。在一定温度范围内，胚胎的发育速度随着孵化温度的升高而加快，孵化期也随之缩短 [10] 。从本实验的结果来看，从26℃~31℃，胚胎发育明显加快，孵化期变短，与已有研究相符 [4] 。
当龟卵从26℃置换到31℃，不管在TSP哪个发育期，胚胎发育均加快；乌龟胚胎发育第15期提高温度，对其孵化期影响最大。同时，只有在胚胎发育第15期将龟卵从31℃置换到26℃才会对孵化期造成显著影响，表明这时候的降温会对乌龟胚胎发育造成显著影响，延长孵化期。以上情况说明，TSP不仅是性别分化的敏感期，其早期可能也是胚胎发育受温度影响的重要期。
4.2. 孵化温度对稚龟性状的影响
乌龟幼体的性状受到孵化温度的影响，本研究结果符合之前的研究发现：低温较高温条件下孵出的幼体更大、更重，但高温孵化可以缩短孵化期，在生产养殖中往往有利。同时，过低或过高的温度下孵出幼体往往发育较差，甚至畸形 [4] 。
研究发现，孵化温度对稚龟重量、背甲长、背甲宽和体高存在显著影响。不管在哪一个时期挪入31℃孵化，孵出幼体性状与一直在26℃孵化的相比均存在显著差异。同时，乌龟卵一直在31℃孵化与在第15期挪入26℃孵化相比，也出现显著差异。这些结果说明，在乌龟胚胎发育TSP早期发生的温度变化将影响到后代的孵出性状。生产实践中往往采用30℃~32℃的孵化温度，孵化周期较短，但该温度下获得的幼龟性别将以雌性为主。因此，如果想要获得更多的雄性，不妨将龟卵先在较低温度下孵化至15期，再置换到有利于加快发育速率的较高温度下。这样既提高了孵出幼体性状指标，又缩短了胚胎孵化期。
基金项目
国家级大学生创新创业训练计划项目(201710351003)，温州大学2017年校级教学改革研究项目(17jg03)。
NOTES
*通讯作者。