1. 引言
标准方法是一种经过全面研究的方法，清楚而严密地说明所需条件和操作程序，用于对物质一种或多种特性值进行测量。CNAS-CL01:2018《检测和校准实验室能力认可准则》 [1] 7.2.1.4条款规定：“当客户未指定所用的方法时，实验室应选择适当的方法并通知客户。推荐使用以国际标准、区域标准或国家标准发布的方法，或由知名技术组织或有关科技文献或期刊中公布的方法，或设备制造商规定的方法。实验室制定或修改的方法也可使用。”在7.2.1.5条款中规定：“实验室在引入方法前，应验证能够正确地运用该方法，以确保实现所需的方法性能。”2018版《检验检测机构资质认定评审准则》 [2] 4.5.14条款规定：“检验检测方法包括标准方法、非标准方法(含自制方法)。应优先使用标准方法，并确保使用标准的有效版本。在使用标准前，应进行证实。”因此，实验室在使用标准方法前，需要对实验室使用标准方法的技术能力是否达标进行验证。
本文以农业部781号公告-4-2006《动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的测定高效液相色谱法–串联质谱法》 [3] 为例做方法验证。此次验证包括：适用范围、标准曲线、线性、灵敏度、精密度及回收率。
2. 材料与仪器设备
2.1. 材料
农业部781号公告-4-2006适用于动物源食品中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林单个或混合物的相应代谢产物AOZ (3-Amino-2-Oxazolidinone)、AMOZ (3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone)、AHD (1-Aminohydantoin)和SEM (Semicarbazide) (结构式见图1)残留量的检测。本方法以猪肉、猪肝、鲫鱼和禽蛋为试验材料，验证该标准是否适用于本实验室。
2.2. 试剂与耗材
AOZ、AMOZ、AHD、SEM浓度均为100 mg/L，农业部环境保护科研监测研究所； AOZ-D4 (>99.0%)、AMOZ-D5 (>99.0%)、AHD-13C3 (>99.0%)、SEM-13C15N2 (>99.0%)，德国Witega公司；二甲基亚砜(>99.0%)、2-硝基苯甲醛(>99.0%)，日本东京化成工业株式会社；乙酸铵(色谱纯)，美国fisher公司；GHP微孔滤器(0.22 μm)，美国waters公司。
Figure 1. The Chemical structures of AOZ (a), AMOZ (b), AHD (c) and SEM (d)
图1. AOZ (a)、AMOZ (b)、AHD (c)和SEM (d)的化学结构式
2.3. 仪器设备
5500型高效液相色谱–串联质谱仪：美国AB公司；XS205电子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；3-18K高速离心机：德国Sigma公司；涡旋振荡器：德国IKA公司；恒温水浴锅(DK-600)，上海冉绘实业有限公司。
3. 试验方法
3.1. 前处理方法
取10,000 r/min匀浆1 min的试料2 ± 0.05 g置离心管中，加100 ng/mL的AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3，SEM·HCl-[1,2-15N2;13C]标准工作液50 µL，再加4 mL 1 mol/L盐酸溶液0.5 mL，50 mmol/L 2-硝基苯甲醛的二甲亚砜溶液150 µL，涡旋混匀。37℃避光水域16 h。
衍生物加0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液5 mL，用5 mol/L氢氧化钠溶液调节PH7.2-7.4，加乙酸乙酯5 mL，涡旋，中速振荡5 min，2000 r/min离心15 min，吸取上清液，加乙酸乙酯5 mL，重复提取一次，合并上清液于50℃氮吹。初始流动相1.0 mL溶解残余物，经滤膜，供高效液相色谱–串联质谱法测定。
3.2. 检测方法
色谱柱：C18，50 mm × 2.1 mm，3 µm；流动相：0.1%甲酸水溶液(A) + 0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脱，梯度见表1；.3柱温：40℃；进样量：5 µL；离子源：电喷雾ESI，正离子；扫描方式：多反应监测MRM；气帘气：30.0；离子源温度：650℃；Gas 1：60.0；Gas 2：55.0；监测离子对及对应质谱参数，见表2。
Table 1. The mobile phase gradient of liquid chromatography for the separation of nitrofuran metabolites
表1. 分离硝基呋喃类代谢物的液相色谱流动相洗脱梯度
Table 2. The acquisition parameters of UPLC-MS/MS for analysis of nitrofuran metabolites and their isotopic labels
表2. 硝基呋喃类代谢物及其同位素标记物的主要质谱参数
3.3. 标准曲线的制作
精密量取2.5、5.0、10、20、50、100、200 ng/mL AOZ，AMOZ，AHD，SEM混合标准工作液100 µl置不同离心管中。按3.1处理，制得0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和20.0 ng/mL各个浓度，利用2.2进行测定，每个浓度测定2次。
3.4. 灵敏度的验证
本标准中，AOZ、AMOZ、AHD、SEM在动物源食品中的检测限为0.25 ng/g，定量限为0.50 ng/g。在每种样品中加入适量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合标准溶液，使AOZ、AMOZ、AHD、SEM在样品中的浓度分别为0.25 ng/g和0.50 ng/g，每种样品每个浓度重复10次，按照3.1进行前处理，利用3.2进行检测。若浓度为0.25 ng/g时，信噪比大于等于3，则实验室的检测限满足标准检测线；若浓度为0.50 ng/g时，信噪比大于等于10，则实验室的定量限满足标准定量线 [4] 。
3.5. 精密度的验证
中华人民共和国农业部第235号公告规定，呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林均为禁止使用药物，在动物性食品中不得检出。因此，在检测限、2倍检测限和10倍检测限3个浓度水平进行检测 [5] ，每种样品每个浓度水品重复10次，计算相对标准偏差。
3.6. 回收率的验证
在每种样品中加入适量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合标准溶液，使AOZ、AMOZ、AHD、SEM在样品中的浓度分别为0.5 ng/g、1.0 ng/g和2.5 ng/g，每种样品每个浓度重复10次，按照3.1进行前处理，3.2进行检测。
4. 验证结果
4.1. 标准曲线
将3.3中得到的各浓度标准溶液，按照方法3.2进行检测，每浓度检测2次。以标准溶液中目标物的浓度为横坐标，对应浓度目标物峰面积与相应同位素内标峰面积比值为纵坐标，得到AOZ、AMOZ、AHD、SEM的标准曲线(见图2)和线性方程及相关系数(见表3)。
由表3看出，AOZ、AMOZ、AHD、SEM线性方程的相关系数均大于0.99，相关性良好，可用于准确定量 [6] 。
(a) 
(b) 
(c) 
(d)
Figure 2. The standard curves of AOZ (a), AHD (b), AMO Z (c) and SEM (d)
图2. AOZ (a)、AHD (b)、AMOZ (c)、SEM (d)的标准曲线
Table 3. The Linear equations and correlation coefficients of AOZ, AMOZ, AHD and SEM
表3. AOZ、AMOZ、AHD、SEM的线性方程及相关系数
4.2. 灵敏度
在每种样品中加入适量的AOZ、AMOZ、AHD、SEM混合标准溶液，使AOZ、AMOZ、AHD、SEM在样品中的浓度分别为0.25 ng/g和0.50 ng/g，每种样品每个浓度重复10次，按照3.1进行前处理，利用3.2进行检测。经检测发现，当各样品中AOZ、AMOZ、AHD、SEM浓度为0.25 ng/g时，信噪比均大于3；当各样品中AOZ、AMOZ、AHD、SEM的浓度为0.50 ng/g时，信噪比均大于10。由此可见，本实验室的方法检测限和定量限均满足农业部781号公告-4-2006的要求。
4.3. 精密度
每种样品在检测限、2倍检测限和10倍检测限3个浓度水平进行检测,每种样品每个浓度重复10次，按照3.1进行前处理，利用3.2进行检测，得到表4所示结果。
Table 4. The precisions of AOZ, AMOZ, AHD, SEM in Pork, Porkliver, Carp and Eggs
表4. AOZ、AMOZ、AHD、SEM在猪肉、猪肝、鲫鱼、禽蛋的精密度
由表4可以看出，4种化合物在猪肉、猪肝、鲫鱼和禽蛋中添加回收的相对标准偏差均小于30%，满足农业部781号公告-4-2006的要求。
4.4. 回收率
添加AOZ、AMOZ、AHD、SEM，使其在各种样品中的浓度分别为0.5 ng/g、1.0 ng/g和2.5 ng/g，每种样品每个浓度重复10次，按照2.1进行前处理，利用2.2进行检测，得到表5所示结果。
Table 5. The recovery rates of AOZ, AMOZ, AHD and SEM in Pork, Porkliver, Carp and Eggs
表5. AOZ、AMOZ、AHD、SEM在猪肉、猪肝、鲫鱼、禽蛋的回收率
由表5可以看出，4种化合物在猪肉、猪肝、鲫鱼和禽蛋中添加回收率均在60%~120%，满足农业部781号公告-4-2006的要求。
5. 结论
经过验证，本实验室在适用范围、标准曲线、线性、灵敏度、精密度及回收率均满足农业部781号公告-4-2006动物源食品中硝基呋喃代谢物残留量的测定高效液相色谱法–串联质谱法的要求，本实验室可以利用此标准对外开展检测业务。