1. 引言
核桃(Juglans regia Linn)又称胡桃、羌桃，是胡桃科植物，胡桃科核桃属落叶乔木，是核桃属植物中经济价值最高的一种，在中国进行栽种的历史悠久，种植资源丰富，在我国新疆，山东，云南等省份都普遍种植，截止到2004年，全国核桃树的栽培面积约91.75 hm2，种植颗数在2亿株左右，面积和数量均居世界第一位。为了充分利用核桃青皮这一资源，已有学者对核桃青皮提取物的除草、杀虫以及抗病毒等农药活性做了研究 [1] ，核桃青皮为核桃没有成熟时外部的一层绿色果皮，其涩、微寒、味苦、有毒 [2] 。据研究表明，核桃青皮的提取物可以抑制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌 [3] ，对甘薯黑斑病菌、马铃薯晚疫病均有抑制作用 [4] ，对萝卜蚜虫具有较强的拒食和触杀活性 [5] ，对小麦赤霉病菌等有抑制作用 [6] ，还具有较强抗病毒、除草活性 [7] ，已有实验结果表明核桃青皮乙醇提取物均可以抑制供试病原真菌的活性。如核桃青皮乙酸乙酯萃取相在浓度为40 mg/ml时抑菌效果最好，对小麦纹枯、番茄灰霉、棉花立枯3种病原真菌的抑制率均为100% [8] 。由此看出，核桃青皮均有抑菌性。本研究选取了两种常见的果树病原真菌，苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌，利用乙醇对核桃青皮进行提取，检测乙醇提取物对这两种病原菌的抑制作用，目前我国大力推广油料植物立体种植，在无公害生产中，防治病害化学农药品种使用受到限制，而核桃本身发病少，为此，开展本次试验主要为了在核桃中发现对牡丹叶斑病菌有抑制作用的物质，开辟新的牡丹病害的无公害防治途径。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
核桃青皮(采自沂蒙山区核桃树)；100%无水乙醇(分析纯)、PDA培养基。供试菌种苹果轮纹病菌(Physalospora nasei)桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)种病原菌由植物病理实验室提供。
2.2. 培养基配制
PDA培养基：200 g土豆，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1000 ml水。
首先洗净去皮马铃薯，然后将其切碎，加水1000 ml煮沸半小时，用纱布将马铃薯滤掉，将其滤液加水补足到1000 ml，然后加琼脂和葡萄糖，然后加热使琼脂完全熔化后，趁热用纱布过滤掉滤渣，然后分装三角瓶，加棉塞，121℃，高压灭菌20 min。
2.3. 核桃青皮粗提取物的提取
核桃青皮干粉和无水乙醇按1:10比例混合，先称取200 g，合并萃取液三次，并在过滤后，将滤液浓缩在电动恒温水浴中以得到粗提取物，即核桃剥离，将其放置在一个灭菌的烧瓶加盖并预留的粗提取物。
2.4. 室内抑菌测定
定量培养基的制备：严格量取27 ml液体PDA培养基及0.54 g琼脂粉装于三角瓶中，封口，121℃，灭菌20 min。
含有提取物的培养基制备：加热并熔化定量培养基，将其冷却至50℃~55℃，加入3 ml原浓缩液和10倍、100倍稀释液，并加少量链霉素抑制细菌生长，充分摇匀后迅速倒入3个培养皿中，浓度恰好是上述浓缩液和稀释液的十分之一，即得到提取物稀释10倍、100倍、1000倍的培养基，等到凝固后，标记各培养皿提取物的浓度，对照组的培养基加3 ml的无菌水 [9] 。
菌饼的制备：待分离鉴定的菌种的培养需要在25℃恒温条件下进行，等到菌丝长到培养基的2/3时，再用直径0.7 cm打孔器在菌落的边缘打取菌块，即为接种用的菌饼。
菌饼的接种与培养：培养基凝固后，将菌饼接种到培养皿，并且滤饼加入到各培养皿，在恒温培养箱中培养，观察其生长情况，测量菌落的直径。
菌落直径的测定：3株菌培养3、5、7 d，用“十”字交叉法测量三组菌落的增长直径，分别测量每个菌落的最大和最小直径，取其平均值，然后减去接种菌饼的直径，即为菌落直径。
2.5. 过氧化氢酶活性测定
参考蔡庆生 [10] 主编的《植物生理学试验》过氧化氢酶的活性分别采用电导法、丙二醛含量测定法和过氧化氢酶活性测定法进行测定。
2.6. 数据处理
抑制生长率(%) = [(对照菌落平均直径-处理菌落平均直径)/对照菌落平均直径] × 100 [8] 。
数据处理采用SPSS 21.0对实验结果进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。
3. 结果与分析
3.1. 不同浓度乙醇提取物对苹果轮纹病菌的抑菌测定
将乙醇提取物分别稀释10倍、100倍、1000倍后，再对抑制效果进行统计，结果如表1所示。
Table 1. Antimicrobial activities of alcoholic extracts with different concentrations on Physalospora nasei
表1. 不同浓度乙醇提取物对苹果轮纹病菌的抑菌效果
*说明：不同小写字母表示处理间0.05水平上差异显著(P < 0.05)；不同大写字母表示0.01水平上差异极显著(P < 0.01)。
对表1分析可得出，乙醇提取物在稀释10倍时抑菌效果均为100%，稀释100倍和1000倍后，抑菌效果显著降低。10倍和100倍液之间具有差异极显著，100倍和1000倍倍液之间在0.01水平和0.05水平上无显著差异。
3.2. 不同浓度乙醇提取物对桃褐腐病菌的抑菌测定
桃褐腐病菌经过不同浓度乙醇提取物处理后，连续培养，期间测定其抑菌直径，结果见表2。
Table 2. Antimicrobial activities of alcoholic extracts with different concentrations on Monilinia fructicola
表2. 不同浓度乙醇提取物对桃褐腐病菌的抑菌效果
*说明：不同小写字母表示处理间0.05水平上差异显著(P < 0.05)；不同大写字母表示0.01水平上差异极显著(P < 0.01)。
表2结果表明，10倍和100倍液、1000倍液之间具有差异极显著，100倍和1000倍倍液之间无显著差异性，且乙醇提取物的抑菌率基本是随浓度的降低而降低。
3.3. 过氧化氢酶活性的测定
从表1和表2可以看出，核桃青皮乙醇提取物在稀释10倍时抑菌效果最好。因为微生物在受到外界迫害时会产生过氧化氢，过氧化氢酶是一种酶类清除剂，它可以促进过氧化氢酶分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于过氧化氢毒害，因而，过氧化氢酶活性值的检测可以作为微生物防御功能的重要指标之一。我们在培养的菌液中加入10倍乙醇提取物处理2小时，来检测两种菌液中的过氧化氢酶的活性，结果如表3所示。
Table 3. Catalase activities of the two strains after treatment with 10-times alcoholic extracts
表3. 10倍乙醇提取物处理后两株菌的过氧化氢酶活性
表3结果表明，核桃青皮提取物对病菌的抗逆性有一定限制，抑制了酶的活性。
4. 讨论
据文献报道，核桃和同属植物核桃富含次生物质，包括酚类，黄酮类，香豆素类，木质素类，生物碱，糖苷和有机酸等 [11] ，它具有更好的农药活性。它可以抑制多种真菌，并抑制细菌 [12] 。中国核桃资源丰富，但核桃青皮的利用率不高。当核桃收获季节，青皮常被作为垃圾处理，造成环境污染。据悉，核桃青皮含有具有抗真菌的抗菌活性丰富的次生代谢产物 [13] 。如果新技术可以通过，新的方法将大力开发和利用核桃青皮。将其变废为宝，核桃青皮将会成为很好的杀菌剂生产原材料，本实验仅对核桃青皮的乙醇提取物对苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌的抑菌效果进行了初步讨论。因此，有必要确定来自核桃绿色果皮的提取物的具体组合物，抗菌谱，作用方式，作用机理。对其他植物上的抑菌进一步的研究和讨论，提高核桃青皮的利用价值，并为斑病的无公害防治开辟了新的途径。
基金项目
山东省自然科学基金(ZR2017BC081)，国家重点实验室开放项目(2017KF08)，大学生创新训练计划(cx2019096)，大学生创新训练计划(cx2019044)。