1. 引言
红景天为景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola L.)多年生草本或亚灌木植物，多生长在1,700 m海拔以上的高山苔原带的裸露岩石山上，生存环境恶劣，主要分布于北半球的亚北极地区，包括北欧、中欧、亚洲和北美 [1] [2] [3]。红景天具有多种药用功效，被誉为“藏人参”，在亚洲和欧洲国家有着很长的民间药用历史 [4]。红景天属植物在全球有90多种，其药用功效主要有治疗肺炎、传染病的发烧和清血管热等。近年来，国内外对红景天属植物的研究方兴未艾，目前已知其不仅具有抗氧化、抗疲劳类似适应原的作用，还有抑制肿瘤的活性等功效 [5] [6]。红景天在传统中医中具有“固本扶正”之功效，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能，防止老年疾病等功能 [7]。红景天的化学成分主要有苷类、黄酮类、香豆素类、生物碱类等，其中研究公认的活性药效成分为红景天苷、甙元酪醇及络塞维 [6] [7] [8]。
红景天大多为天然资源，由于其生存在高寒等恶劣环境，自然生长缓慢，故年产量低，同时随着其需求量的增大，使得本来就较为稀少的野生红景天严重缺乏。为了解决这个问题，研究人员开始从多种途径来解决红景天的需求问题 [9]。红景天组织培养可以克服其自然繁殖率低、野生资源短缺等难题。有研究表明，以植物细胞培养为材料生产次生代谢物具有培养周期短、材料均一、重复性好等优点 [10]。红景天中含有大量次生代谢物，因此，建立稳定而具有高活力的红景天细胞愈伤组织体系对次生代谢物的生产有重要意义。本研究在红景天组织培养研究的基础上，分析了培养条件对愈伤组织生长量以及红景天苷含量的影响，为通过植物细胞组织培养利用红景天次生代谢产物提供理论依据。
2. 材料与方法
2.1. 植物材料
试验所需植物材料来源于四川省藏区红景天属。
2.2. 外植体的处理
叶片、茎、根用清水冲洗干净，再用75% (V/V)酒精浸泡1 min，用无菌水清洗3次，然后放入0.5%的氯化汞(HgCl2)溶液浸泡3 min，最后用无菌水冲洗干净。
2.3. 愈伤组织的诱导和继代培养
将无菌的叶片切成1 cm2的小块，块中可带有中脉或是叶缘，接入愈伤组织诱导培养基。愈伤组织诱导培养基配方为如下：MS [11] + 1.0~3.0 mg/L 6-BA，或是MS +1.0~3.0 mg/L 6-BA + 0.1~0.4 mg/L NAA + 0.05~0.2 mg/L 2,4-D。愈伤组织诱导培养基附加有3%蔗糖、0.7%琼脂粉，pH = 5.8，室温 28 ℃。叶块分为2组，一组置于光周期16 h/8 h中培养，光强2000Lx；另一组暗培养，均培养20 d，对比光培养与暗培养对愈伤组织的影响。愈伤组织诱导设计为20个叶块一个处理，3次重复。20 d后，将诱导出的愈伤组织切成1.0 cm3的小块，分成2组，一组接入再生培养基诱导不定芽，另一组转接入新鲜的愈伤组织诱导培养基中进行继代培养，每20 d重复一次，比较多次继代培养对愈伤组织的影响。
2.4. 甲基茉莉酸处理浓度对红景天生长和红景天苷积累的影响
为了筛选适宜的甲基茉莉酸(MeJA)浓度，在愈伤组织诱导培养基中分别加入MeJA 5.0、25.0、50.0、100.0 mg/L，以未加MeJA为对照(0 mg/L)，将第1代愈伤组织从培养基上取出，切块称重后置入加有MeJA的愈伤组织诱导培养基进行培养，分别取4、8、12 d材料后测定生物量、红景天苷含量。
2.5. 生物量的测定
将收取的愈伤组织用自来无菌水冲洗2~3次后，洗掉附着的培养基，用灭菌滤纸吸干愈伤组织表现上的水分，称鲜物重。最后放入40℃的干燥箱中烘干，48 h后称干物重。
2.6. 红景天苷含量的测定
精确称取红景天苷标准品10 mg溶解定容至10 mL 量瓶中，摇匀，配制成1.0 g/L的对照品溶液，移液器吸取前述溶液0.50，0.75，1.00，1.25，1.50，1.75，2.00 mL置于10 mL量瓶中并用甲醇定容至10 mL，分别稀释成0.05，0.075，0.10，0.125，0.15，0.175，0.20 g/L的对照品溶液进行高效液相色谱检测，绘制标准曲线。
称取红景天愈伤组织干燥粉末0.50 g至50 mL三角瓶中，加入10 mL甲醇，溶解摇匀并在超声波125 W条件下，超声处理30 min后，将其放入75℃恒温水浴锅中加热5 h，冷却后补足甲醇至原质量，取上清液经过0.22 μm 的过滤器进行过滤，避光低温保存，待高效液相色谱检测备用。检测波长为275 nm；流动相甲醇-水(85:15)；流速1 mL/min；进样量10 μL；检测温度28℃；保留时间11.5 min。
2.7. 计算方法
愈伤组织诱导率 = (愈伤组织块数/接种外植体数) × 100%
试验数据用SPSS软件进行方差分析，采用邓肯氏最小显著差数测验进行差异分析，显著水平为0.05，每个处理3次重复。
3. 结果与分析
3.1. 愈伤组织的诱导
3.1.1. 植物生长素对愈伤组织的诱导
将叶片接种到愈伤组织诱导培养基后，7 d内就会产生愈伤组织。表1显示，6-BA是诱导红景天叶片产生愈伤组织的关键植物生长调节剂，培养基中添加6-BA，可顺利诱导叶片出愈。随着6-BA浓度的升高，叶片出愈率随之升高，但愈伤组织的质地变得松散。浓度2.0 mg/L的6-BA能诱导85.59% ± 3.1%的叶片产生瘤状愈伤组织，3.0 mg/L的6-BA虽然也能诱导愈伤组织大量产生，但愈伤组织质地疏松，瘤状结构稀少，再生能力差。添加NAA、2,4-D后发现，浓度0.2 mg/L的NAA和0.1 mg/L的2,4-D对红景天叶片形成愈伤有促进作用。2.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L的NAA及0.1 mg/L 2,4-D的组合对诱导红景天叶片产生瘤状愈伤组织的效果最佳，诱导率高达95.96% ± 2.3%。
Table 1. Effect of plant growth regulators (PGRs) on callus induction from leaf of Rhodiola; The different letters in the same column mean the significant difference (P ≤ 0.05) by Duncan’s LSD Test. The same below
表1. 植物生长调节剂对红景天叶片愈伤组织诱导的影响；表中不同字母表示邓肯氏最小显著差数测验差异显著(P ≤ 0.05)。其它表同
3.1.2. 不同外植体对愈伤组织诱导的影响
用叶片、茎、根3种外植体分别在筛选后的培养基上进行愈伤组织诱导，发现在最佳愈伤组织诱导培养基上，3种材料的出愈率差异不显著(表2)。因此，多组合的愈伤组织诱导培养基可以很好缓冲不同外植体差异的影响，稳定诱导愈伤组织。
Table 2. Effect of different explant tissues on callus induction from Rhodiola
表2. 外植体对红景天愈伤组织诱导的影响
3.1.3. 光周期对愈伤组织诱导的影响
外植体分别进行光培养与暗培养15 d，观察发现光培养与暗培养均能诱导愈伤组织形成。暗培养产生的愈伤组织出现早，平均4 d就能观察到愈伤产生，且体积大、质地松散、无法分化，须在光下培养10 d，并转绿后才能恢复分化能力。光培养条件下，至少5 d后才有愈伤组织生成，但愈伤组织颜色墨绿，质地紧密，瘤状结构明显；30 d后愈伤组织则需要继代培养。
3.1.4. 继代次数对愈伤组织及红景天苷含量的影响
多次继代培养会使愈伤组织的结构和颜色发生明显变化。随着继代次数的增加，愈伤组织逐渐失绿褐化，增殖能力下降，质地变得松散，瘤状结构消失；同时红景天苷含量在前3代基本稳定，且随继代数的增加有上升趋势，但到第4代开始，红景天苷含量明显下降(表3)。结果表明，继代次数过多不仅影响愈伤组织生长，使其增殖能力下降，同时也影响红景天苷的积累。
Table 3. Effect of subculture times on callus growth and salidroside contents of Rhodiola
表3. 继代次数对愈伤组织生长和红景天苷含量的影响
3.2. 甲基茉莉酸处理天数对愈伤组织生长及红景天苷积累的影响
愈伤组织在培养10 d后，加入25 mg/L的MeJA，分别处理0，4，8，12 d后发现，加入MeJA 0~4 d 时，愈伤组织的干物重基本稳定。在培养的第4 d，愈伤组织中红景天苷含量达最大值(表4)。同时随着培养时间继续增加，干物重及红景天苷的含量和产量也开始大幅度下降。因此，在愈伤组织培养第10 d加入Me-JA处理4 d为最佳处理天数。
Table 4. Effect of MeJA treatment days on callus biomass and accumulation of salidroside in Rhodiola (n =10)
表4. 甲基茉莉酸处理天数对红景天愈伤组织生长和红景天苷积累的影响(n = 10)
3.3. 甲基茉莉酸浓度对愈伤组织生长和红景天苷积累的影响
在培养10 d后添加不同浓度的MeJA 发现，随着MeJA浓度升高，愈伤组织干物重不断下降。相反在0~100 mg/L时，红景天苷的含量和生产量在逐渐增加，当MeJA的浓度为100 mg/L时，达到最大值(表5)。因此，本试验选择MeJA浓度为25 mg/L作为愈伤组织生长生产和红景天苷含量的最适浓度。
Table 5. Effect of the concentration of MeJA on callus biomass and accumulation of salidroside in Rhodiola (n = 10)
表5. 甲基茉莉酸浓度对红景天愈伤组织生长和红景天苷积累的影响(n = 10)
4. 讨论
适宜的激素水平、继代次数以及愈伤组织疏松程度是红景天愈伤组织培养体系建立所必需的。本实验对红景天的愈伤组织诱导进行了研究，结果显示多组合的植物激素配合可以有效地缓冲外植体类型差异的影响，稳定诱导愈伤组织。植物激素在愈伤组织增殖生长中起关键作用，生长素与细胞分裂素的多种组合使用优于单一生长调节剂；继代培养时间对红景天愈伤组织生长能力有较明显的影响，随着继代时间的延长，活力逐渐下降。红景天属于高山植物，在低海拔区生长时，其生长状态会受到一定的影响，最直接的表现是生长速度有可能减慢，对愈伤组织的形成及生长产生不利影响。红景天初代愈伤组织是由颜色、质地和形态无明显差异的细胞团块形成，经继代后产生绿色致密型、略黄色致密型等外观，但不影响稳定生长。
茉莉酸类化合物在植物中，主要分布于植物的幼嫩组织、花和生殖器官中；在植物发育过程，调节植物的生长发育、防御应答以及通过调节生长和胁迫应激的代谢流来调节次生代谢 [12] [13]，起着重要的内源激素作用 [14]。同时，其能够以信号分子的形式参与到植物次生代谢，激活相应的防御基因，调控相关关键酶基因的表达，影响酶活性，进而调控次生代谢物的生产 [15]。研究报道显示，不同时期的细胞对诱导子的反应灵敏度不同，只有当细胞达到一定的生长时期才可以有效的接受诱导信号，此时诱导子表现出最强的诱导活性。有研究报道显示，夹竹桃细胞培养初期加入MeJA 100 mg/L，培养21天后，甲黄次苷的生产量达8.93 mg/L为最大值 [16]。本研究认为愈伤组织生长到第10天时，加入25 mg/L MeJA培养4 d后，有利于红景天愈伤组织的生长和红景天苷的积累。由此可见，在愈伤组织培养过程中，所加入的甲基茉莉酸的浓度及时间对红景天愈伤组织中有效物质的积累有显著差异。
基金项目
四川省科技计划项目(2018NZ0091、2019YFS0107)、四川省级公益性科研院所基本科研业务费项目、农业农村部杂粮加工重点实验室开放基金资助(No.2018CC12)、四川省中医药管理局科研项目(2018KF007)共同资助。
NOTES
*通讯作者。