摘要: 本文研究不同纯度的辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)催化降解苯甲醛的效果。实验室制备商业级产品A (RZ > 0.8，酶活 > 80 U/mg)，B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)，C (RZ > 3.0，酶活 > 300 U/mg)三种不同纯度的辣根过氧化物酶。通过改变时间、温度、pH、反应物浓度和酶量等变量探究产品B催化转化苯甲醛的最佳反应条件。利用获得的最佳反应条件，确认产品A和C催化降解苯甲醛的效果，发现产品B与A有明显差别，与C没有显著性差别。考虑到不同纯度HRP产品存在显著的价格差异，本研究认为，产品B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)对于降解苯甲醛而言具有最佳经济适用性。
Abstract:
In this paper, the effects of horseradish peroxidase (HRP) with different purities on the catalytic degradation of benzaldehyde were evaluated. Products A (RZ > 0.8, enzyme activity > 80 U/mg), B (RZ > 1.5, enzyme activity > 150 U/mg) and C (RZ > 3.0, enzyme activity > 300 U/mg) were prepared in our lab. The parameters including time, temperature, pH, reactant concentration and enzyme amount were optimized. Using the optimal parameters, the effects of products A and C were evaluated. The results indicated that products B was significantly different from A but similar with product C. Considering the economic issue, these results indicated that Product B (RZ > 1.5, enzyme activity> 150 U/mg) might be the best choice to degrade benzaldehyde for industry.
1. 引言
辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)是一种来源于辣根根部的血红素蛋白酶 [1] [2]，被广泛运用于生物医疗 [3] [4] [5] [6] 、日用化工 [7] [9] 、以及环境保护 [10] [11] 等领域。商品化的HRP，由于纯度不同，价格存在显著差异(以BBI公司产品为例，RZ > 1.5的HRP价格为136.8元/100 mg，RZ > 3.0的HRP价格为320.0元/100 mg)。实现HPR使用目的与成本的最优平衡，获得最佳性价比的方案是工业界的持续关切。苯甲醛作为一种简单的芳香醛广泛用于食品、香料及制药等行业 [12] [13]，产生的苯甲醛污染一直以来用HRP催化过氧化氢降解来治理 [14] - [18]。然而，罕有文献报道HPR降解苯甲醛的效率与成本之间关系的研究。
本文首先根据Barnard [19] 、Mohamed [20] 等人以及Mejri [21] 等人的相关研究确定从辣根中提取纯化HRP的实验方法，根据孙海霞的超滤提取HRP法 [22] 以及Carpenter等人的冻干蛋白制剂法 [23]，得到产品A (RZ > 0.8，酶活 > 80 U/mg)，产品B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)，产品C (RZ > 3.0，酶活 > 300 U/mg)三种不同纯度的辣根过氧化物酶。之后，选用产品B催化氧化苯甲醛，依次从反应时间、温度、pH值、反应物浓度和酶量等方面探索最佳反应条件。最后，在最佳条件下，比较产品A、B以及C的催化降解能力。发现产品B的降解效果与产品C和BBI产品(RZ > 3.0，320.0元/100 mg)没有显著性差异，但与产品A存在明显差异。对于催化氧化苯甲醛而言，产品B具有最佳性价比。本研究可以为合理使用不同纯度HRP，降低使用成本提供思路。
2. 仪器与试剂
2.1. 仪器
BT600-2J蠕动泵，保定兰格恒流泵有限公司；752型紫外可见分光光度计，舜宇恒平有限公司；KQ-700E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；5810R型离心机，Eppendorf仪器有限公司；pH酸度计，梅特勒–托利多仪器有限公司；玻璃层析柱，上海煊盛生化科技有限公司；BSM电子天平，上海卓精电子科技有限公司；成套超滤装置，美国Spectrum仕必纯有限公司。
2.2. 试剂
99.5%三羟基氨基甲烷，北京百灵威科技有限公司；柱蛋白纯化填料，武汉汇研生物技术股份有限公司；无水乙酸钠，上海泰坦科技股份有限公司；冰乙酸，国药集团化学试剂有限公司；盐酸，国药集团化学试剂有限公司；分析纯硫酸铵，上海泰坦科技股份有限公司；氢氧化钠，上海泰坦科技股份有限公司。30%过氧化氢，国药集团化学试剂有限公司；苯甲醛，国药集团化学试剂有限公司。HRP RZ > 1.5、HRP RZ > 3.0，BBI生命科学公司。
3. 实验方法
3.1. 辣根过氧化物酶的分离纯化
分离纯化步骤如图1。将辣根冷冻、切碎、硫酸铵萃取后用硅藻土吸附，10 kD水性微孔滤膜滤去固相，超滤浓缩液相后，通过硫酸铵分级分离，再次收集液相超滤浓缩。将浓缩液载入CM琼脂糖凝胶色谱柱，碱性洗脱，超滤浓缩，冻干后得到产品A。酸性洗脱CM琼脂糖凝胶色谱柱，超滤浓缩洗脱液并载入DEAE琼脂糖凝胶色谱柱，酸性洗脱液超滤浓缩后冻干，得到产品B。碱性洗脱DEAE琼脂糖凝胶色谱柱，超滤浓缩洗脱液后载入Phenyl琼脂糖凝胶色谱柱，酸性洗脱，超滤浓缩洗脱液，冻干后得到产品C。三种不同纯度的HRP产品分别为A (RZ > 0.8，酶活 > 80 U/mg)，B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)，C (RZ > 3.0，酶活 > 300 U/mg)。根据酶活计算总收率产品A为96%，产品B为62%，产品C为39%。(U的定义：在20℃，pH值为6.0的条件下，前20秒内催化产生1毫克红棓酚的酶数量)。
3.2. 影响苯甲醛去除率的单因素实验
当用紫外分光光度法同时测定苯甲醛和苯甲酸混合液含量时，溶液在250 nm处的吸光度值与苯甲醛浓度成正比 [24] [25]。配制空白样与测试样(表1)，在250 nm下用空白样调零后读取测试样的吸光度值，记为A1，反应后的吸光度值记为A2，按照下列公式计算出去除率(α)，从而确定处理效果：
α = (A1 − A2)/A1 × 100%。
Table 1. Compositions of the reaction solution
表1. 反应液组成
a) 反应时间对苯甲醛降解率的影响
在反应温度40℃，磷酸缓冲液pH为7，苯甲醛溶液浓度为5 mmol/L，30%氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L，HRP浓度为20 ug/mL的条件下，分别读取反应0、20、40、60、80、100 min时的吸光度值，求得降解率。
b) 反应温度对苯甲醛降解率的影响
在最佳反应时间下，在磷酸缓冲液pH为7，苯甲醛溶液浓度为5 mmol/L，30%氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L，HRP浓度为20 ug/mL的条件下，分别读取反应温度为10、20、30、40、50、60℃时苯甲醛的降解率。
c) 缓冲液pH对苯甲醛降解率的影响
在最佳反应时间和最佳反应温度下，保持苯甲醛溶液浓度为5 mmol/L，30%氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L，HRP浓度为20 ug/mL不变，考查磷酸缓冲液pH为4，5，6，7，8，9时苯甲醛的降解率，得到该反应的最适pH。
d) 探索苯甲醛起始浓度对苯甲醛降解率的影响
在最佳反应时间、最佳反应温度、最适pH下，控制30%氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L以及HRP浓度为20 ug/mL的条件不变，改变苯甲醛起始浓度1，2，3，4，5，6，7 mmol/L时，根据苯甲醛降解率的变化探究苯甲醛起始浓度对反应的影响。
e) 探索过氧化氢浓度对苯甲醛降解率的影响
在最佳反应时间、最佳反应温度、最适pH，最适苯甲醛起始浓度下，探究过氧化氢浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mol/L时的降解率。
f) 探索辣根过氧化物酶浓度对苯甲醛降解率的影响
分别配制辣根过氧化物酶浓度为10，20，30，40，50 ug/mL的酶溶液，在最佳反应时间、最佳反应温度、最适pH，最适苯甲醛起始浓度，最适过氧化氢浓度下，测算降解率。
3.3. 不同纯度酶对苯甲醛去除率的影响实验
使用产品B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)，设计单因素实验，依次确定了最佳反应时间、最佳反应温度、最适pH，最适苯甲醛起始浓度，最适过氧化氢浓度和最适HRP浓度。之后，在最优条件下检测产品A (RZ > 0.8，酶活 > 80 U/mg)和产品C (RZ > 3.0，酶活 > 300 U/mg)对苯甲醛去除率的影响。
4. 结果与讨论
4.1. 影响苯甲醛去除率的单因素实验结果
使用产品B在考查时间变量的实验中发现，前60 min降解率随着时间延长而增加，60 min时降解率达到57.4%。之后的40 min内，降解率维持在57.4%左右并不再随时间延长而变化，说明反应在60 min到达终点(图2a)。因此，我们选用60 min作为后续研究的终点时刻。接下来我们考查了反应温度对降解率的影响情况，当反应温度在10℃至40℃时，苯甲醛的降解率随温度的升高而升高，40℃时降解率出现峰值。若反应温度大于40℃，降解率随着温度的升高反而呈下降趋势(图2b)。这一结果显示，温度较低时，酶活较低，导致降解率低，随温度升高反应加剧，降解率升高，但超过40℃后，酶蛋白变形失活，导致苯甲醛的降解率反而出现下降。相关文献也有类似的结论 [26]。固定反应时间60 min，反应温度40℃，调节缓冲液pH值，发现在pH 4~6之间，酶的降解活性随着pH值的增大而增强，当pH值到达6时，酶的活性达到峰值59.4%，略高于pH为7时的情况，说明弱酸环境更利于此反应(图2c)。对于不同浓度的苯甲醛，在酶浓度为20 ug/mL时，降解率依旧维持在59.4%左右，该结果表明，苯甲醛初始浓度对该反应的影响不大(图2d)固定反应时间60 min、温度40℃、pH值6、苯甲醛的浓度5 mmol/L，酶浓度20 ug/mL，改变过氧化氢的浓度(0.1~0.8 mol/L)后发现，苯甲醛的降解率在0.5 mol/L之前随着浓度的增大而增大，在0.5 mol/L之后维持在峰值59.4%左右，过氧化氢浓度的增加对降解率的增加没有显著提高(图2e)。使用产品B在表1所配的反应体系中，设置反应时间60 min，反应温度为40℃，磷酸缓冲溶液pH为6，苯甲醛溶液浓度为5 mmol/L，过氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L，HRP浓度为20 ug/mL时，苯甲醛的降解率59.4%。当HRP浓度大于等于30 ug/mL时，苯甲醛的降解率可达到最大值64.7% (图2f)。
4.2. 不同纯度酶对苯甲醛去除率的影响
Figure 3. Relationships between HRPs with different purities and the removal rates of benzaldehyde within 60 min
图3. 不同纯度辣根过氧化物酶60 min内与苯甲醛去除率的关系
图3中五根曲线分别代表实验室制备得到的三种不同纯度的HRP产品A (RZ > 0.8，酶活 > 80 U/mg)，B (RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg)，C (RZ > 3.0，酶活 > 300 U/mg)以及BBI公司市售的HRP产品(RZ > 1.5和RZ > 3.0)五种产品，在表1所配的反应体系中，在最优反应条件下(反应温度为40℃，磷酸缓冲液pH为6，苯甲醛溶液浓度为5 mmol/L，过氧化氢溶液浓度为0.5 mol/L，HRP浓度为30 ug/mL，60 min)，降解苯甲醛的曲线图。实验结果显示，产品A的最终降解率为28.7%，比同条件的产品B低36%比产品C低42.8%，产品A的降解效果与产品B和C有显著性差异，产品B与产品C相差6.8%，不存在显著性差别。产品B和C的曲线分别与BBI公司对应的产品基本一致，说明产品B和C与BBI公司相应的HRP产品对苯甲醛的降解效果相当。从经济适用性角度考虑，产品C (RZ > 3.0)对苯甲醛的降解效果仅为产品B (RZ > 1.5)的1.1倍，而价格是产品B的2.3倍(以BBI市售价格为参考)，产品C的纯化流程也较产品B更为复杂，选用RZ > 1.5，酶活 > 150 U/mg的HRP产品进行苯甲醛的降解反应具有最佳性价比。
基金项目
江苏省自然科学基金(BK20190608)和江苏省博士后科研资助计划(2019K220)。