用于研究戊型肝炎病毒的细胞培养系统

Cell Culture System for the Study of the Hepatitis E Virus

摘要: 戊型肝炎病毒(HEV)是人类戊型肝炎的致病因子，也是全世界肠道传播的病毒性肝炎的主要原因。病毒学研究需要强大的细胞培养系统。不幸的是，与其他肝炎病毒一样，HEV难以在常规细胞中繁殖。虽然已经使用各种HEV毒株测试了许多不同的细胞培养系统，但是病毒复制通常进展非常缓慢，并且具有低病毒粒子计数的感染导致HEV复制无效。然而，最近发现在不同细胞系中传代原发患者分离株的进展改善了体外HEV传播。本综述描述了几个典型毒株的细胞培养情况。

Abstract: Hepatitis E virus (HEV) is the causative agent of human hepatitis E and the main cause of viral hepatitis transmitted in the intestines worldwide. Virology research requires a powerful cell culture system. Unfortunately, like other hepatitis viruses, HEV is difficult to reproduce in conventional cells. Many different cell culture systems have been tested using various HEV strains, but virus replication generally progresses very slowly, and infections with low virion counts render HEV replication ineffective. However, recent advances in the passage of primary patient isolates in different cell lines have improved in vitro HEV transmission. This review describes the cell culture of several typical strains.

1. 引言

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是戊型肝炎(Hepatitis E, HE)的病原体，是世界范围内肠道传播的病毒性肝炎的主要原因，但也可能表现出肝外表现，如神经系统综合征，肾损伤和血液病等 [1] [2]。HE占我国急性病毒性肝炎20%左右，病死率为1.4%~5.3%，而孕妇中的病死率可达25%，病毒的垂直传播还会导致不良后果，特别是在妊娠晚期，如早产，流产，死产，宫内感染和新生儿死亡 [3] [4]。这使得HE成为一个重要的公共卫生问题。

HEV属于戊型肝炎病毒科，其中包括正戊肝病毒属和鱼戊肝病毒属 [5]。后一种属仅包括割喉鳟鱼病毒(Cutthroat trout virus, CTV)，而正戊肝病毒属由四种组成：正戊肝病毒属包含了A、B、C和D 4种 [5]。其中A主要感染人和猪、骆驼、兔、雪貂、鼠、鹿、猫鼬等哺乳动物；B主要感染禽类；C主要感染鼠和雪貂；D主要感染蝙蝠 [6] [7] [8]。A包括8个基因型，人是基因1型和2型病毒的宿主，主要在发展中国家发现，通过粪口途径传播；动物是基因3型和4型病毒感染的宿主，包括猪，鹿和猫鼬，野猪，贝类，啮齿动物，野牛，牛和狗，主要存在于发达国家；基因5型和基因6型在日本野猪中分离；2014年，基因7型在中东地区的单峰骆驼中被发现，并广泛分布在巴基斯坦、阿拉伯联合酋长国和四个非洲国家；基因8型在日本的骆驼中被发现 [9] [10] [11] [12]。HEV基因3、4、7型可以跨越物种屏障传播 [13] [14] [15]。

HEV是直径27~34 nm的二十面体病毒，病毒体含有一个大约7.2 kb的单链RNA基因组，其正向可编码三个开放阅读框(Open reading frame, ORF)，具有5’-7-甲基鸟苷酸帽和3’聚(A)尾 [16]。ORF1是最大的病毒基因产物，由甲基转移酶、假定蛋白酶、RNA解旋酶、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)和病毒复制必需的高变区组成；ORF2编码660个氨基酸的病毒衣壳，在病毒基因型中相对保守，并且是中和抗体的主要靶标；ORF3蛋白分别是113或114个氨基酸的13 kDa蛋白质，在准包膜病毒粒子中发现，参与病毒体形态发生和病毒排出 [2] [17] [18]。最近，已经报道了ORF3蛋白的离子通道活性，这对于感染性颗粒的释放是至关重要的 [2]。

该综述总结了部分用于研究HEV的体外培养系统，希望对研究HEV的课题组有所帮助。

2. 毒株

1) 87A

HEV基因1型株的87A最初来自1986~1987年新疆流行期间的一名戊型肝炎患者的粪便中分离到的人胚肺二倍体细胞株(2BS)，该株在2BS细胞中分离后，尝试在其他组织培养细胞中进行病毒的增殖 [19]。由于很难获得足够的2BS细胞培养戊型肝炎病毒，因此急需寻找到适合于戊型肝炎病毒易于培养或对其增殖敏感的细胞系。

为寻找适合HEV增殖的敏感细胞株，将87A株病毒接种于A549、lc-mk、Vero、BHK-21细胞株单层细胞上。结果表明，在上述4个细胞系中，只有A549细胞系对HEV敏感，并观察到细胞病变效应(CPE) [20]。在进行6次传代后，A549细胞系上清液中依旧能检测到大小为239 bp的HEV谱带。使用电镜观察接种了87A株的A549细胞系，可见约为30 nm大小的病毒颗粒。这些结果表明87A株病毒可在A549细胞系中复制 [19]。

2) G93

G93病毒株是从中国广州的HEV分离株G-9相同个体的粪便样品中分离得到的，属于基因1型，与G-9有高度同源性(93%) [21]。通过A549细胞系培养G93株，并通过免疫学和分子生物学技术鉴定。结果显示G93株可以在A549细胞系中繁殖，并在感染24小时后引起CPE，并逐渐发展到第8天 [21]。通过使用免疫电子显微镜观察到，病毒颗粒直径约为29~32 nm，形态与其他来源的HEV相似 [22]。病毒抗原经IFA鉴定，免疫荧光定位于细胞质和细胞膜表面，但不存在于感染细胞的细胞核内。采用间接荧光抗体检测方法，可以通过细胞质和细胞膜上的免疫荧光检测感染细胞中的HEV抗原。有中国的学者利用戊型肝炎患者血清与分离到的病毒，通过Western blotting发现只有G93病毒蛋白的两个片段与血清反应，其中一个片段是被IgM类抗体识别的58 kDa片段，另一个是被IgG抗体识别的82 kDa片段。鉴定了HEV的58-kDa和82-kDa天然结构蛋白 [21]。

3) Sar-55

Sar-55株是从一名巴基斯坦患者分离到的基因1型HEV株，具有广泛的特征，与缅甸株有高同源性 [23]。将Sar-55株分别接种到HepG2/C3A细胞系，LLC-PK1细胞系、鹿细胞系中，发现，Sar-55株能在HepG2/C3A细胞系和LLC-PK1细胞系中复制，并连续传代6次，尽管在LLC-PK1细胞系中复制效率较低 [18]。

将含有10%人类粪便悬液的Sar-55株静脉注射到食蟹猴体内，生化和血清学检测证实，所有接种的动物都被感染了，并表现出丙氨酸氨基转移酶、异柠檬酸脱氢酶、γ-谷氨酰胺转移酶、指示性肝炎的增加 [23]。并且，所有食蟹猴都产生了重组型HEV抗原的抗体。在对上述食蟹猴的粪便、血清和胆汁样本进行了敏感的巢式RT-PCR检测后，发现，戊型肝炎病毒的基因组在第6~35天被检测到。这些结果表明，Sar-55株能够诱导戊型肝炎并引起持续感染 [23]。

4) F23

F23株是从一名摩洛哥28岁的戊型肝炎男性患者的粪便中分离到的基因1型HEV株。将粪便样本悬浮在10%磷酸盐缓冲液中，经离心后，用0.22 μm孔径的微孔过滤器过滤上清液，使用PLC/PRF/5细胞系培养，发现仅导致低滴度的复制，并且没有可见的CPE。虽然有证据证明F23株能在2BS细胞系中复制并连续传代，但获得足够多的2BS细胞系仍较为困难，因此需要开发更多的F23株体外培养系统 [18]。

5) Kernow-C1/P6

Kernow-C1株是从一名慢性感染患者分离到的基因3型HEV株，被用于鉴定可受感染的人、猪和鹿细胞株，该病毒重组包含一个人核糖体蛋白基因的174个核糖核苷酸(58个氨基酸)的插入 [24]。

虽然已知某些基因型3和4毒株可感染猪和鹿以及人类，但没有适合探索宿主范围参数的病毒细胞培养系统。为了开发这样的系统，基因3型HEV株的Kernow-C1从感染HEV的HIV-1患者的粪便中半纯化。将病毒接种于5株人细胞系和1株恒河猴细胞系上，7天后用ORF2衣壳蛋白和ORF3蛋白抗体对细胞进行免疫荧光显微镜染色。由于这些病毒蛋白是从亚基因组信使RNA翻译而来的，它们的存在表明病毒RNA合成已经发生。免疫荧光显示肝细胞瘤细胞系HepG2/C3A对HEV接种后7天的耐受能力最强，而Caco-2、Huh-7.5、PLC/PRF/5和A549细胞的耐受能力较弱 [24]。

半纯化病毒在HepG2/C3A细胞中连续传代6次，共传代7个月。粪便中病毒在HepG2/C3A细胞上形成的病灶分别是在A549和PLC/PRF/5细胞上形成的80倍和90倍，并且在第4代病毒中，病毒在HepG2/C3A细胞中产生的病灶数量比其中的400倍和500倍高。通过粪便和第6代病毒比较感染性病毒和病毒粒子RNA产生的HepG2/C3A细胞的生长曲线证实，粪便病毒的连续传代产生了能够在HepG2/C3A细胞中更有效生长的病毒。在第14天，粪便病毒释放了89 FFU和1.3 × 10⁶基因组当量的RNA/100 μL培养基，以产生1 FFU/15,083基因组当量的特异感染性；在第14天，第6代病毒释放3203 FFU和46.1 × 10⁶基因组当量RNA/100 μL，以产生1 FFU/14,399基因组当量的特异感染性 [25]。使粪便病毒适应在A549细胞或PLC/PRF/5细胞上生长的类似尝试是不成功的 [20]。

6) KM01

猪基因4型戊型肝炎病毒株KM01是从中国云南省昆明市农村的一个村庄分离得到的，那里的猪与人类生活在一起。序列和系统发育分析表明，猪戊型肝炎病毒与新疆分离株(CHN-XJ-SW13)关系密切，表明该株是人畜共患病的，能够跨物种感染人类。KM01菌株的基因组将为进一步研究我国HEV分子流行病学和遗传多样性奠定基础 [26]。

将KM01株接种到Huh 7.5.1、HepG2/C3A、A549、Vero、HEK293T等细胞中，发现均能成功复制，并连续传代4次以上，表明KM01株适合用于体外研究 [27] [28] [29] [30]。

3. 展望

HEV以前被认为是一种“旅行者病”，在发展中国家引起了零星暴发。然而，这种病毒现在被认为是工业化国家急性病毒性肝炎的主要病因，在免疫缺陷患者中尤其成问题。由于这提高了对HEV公共卫生负担的认识，一些研究小组已经建立了细胞模型系统来研究其生命周期和发病机制。然而，关于HEV复制周期问题的许多病毒学问题仍未解决。未来的研究应该继续关注能够产生高病毒滴度的HEV颗粒的强大细胞培养模型。这应该是所有基因型HEV分离株的理想情况，包括动物源菌株。此外，应开发能够有效感染原发性HEV分离株的体外系统。这类系统不仅有助于确定HEV宿主靶标，如特定的细胞受体，而且还将通过简化药物筛选试验和启用候选药物的功能测试，显著支持开发和评估新的抗HEV治疗方案。

4. 新颖性分析

本综述系统的概括了HEV目前研究较多的基因型和典型毒株的体外培养系统，为未来开发更为强大的培养系统，以及疫苗、抗HEV药物的研发奠定了基础。

致 谢

感谢昆明理工大学病毒与免疫课题组提供实验环境。

基金项目

国家自然科学基金项目(81660338, 81960370)；云南省科技厅项目(2017FA036, 2018FB132)；协和青年科研基金项目(3332019008)。

利益冲突

无。