1. 引言
丹参Salvia miltiorrhizae Radix et Rhizoma (SMRR)味苦，性微寒，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎 [1]，川丹参是著名的川产道地药材之一。丹参中的化学成分主要有丹参酮类和丹参酚酸类成分 [2]。现代药理研究表明，丹参具有活血去瘀、通经止痛、具有抗炎、保肝 [3] [4]、抗肿瘤 [5] 等功效。目前，川丹参饮片的加工炮制方法主要是冬季药农田间采挖，除去泥沙，阴干；然后，饮片生产厂家再按饮片生产要求，洗净，润透，切片干燥。由于丹参从田间采收到制成饮片过程中，先期去泥沙干燥后，导致后期净制时需要时间长，有效成分损失大，质量不稳定。本实验测定了两种方法炮制的丹参饮片中丹参酮类和丹酚酸类共7种有效成分的含量，并对其进行了比较分析，为川丹参饮片生产工艺的改进提供依据。
2. 材料仪器和药品
2.1. 实验仪器
UltiMate3000高效液相色谱仪，XS205型万分之一的天平；METTLER TOLEDO型十万分之一电子天平，超声波提取器KH-600DB；粉碎设备JD-07；DHG-9070A型干燥箱；沃特浦WP-UPT-10标准型超纯水机。
2.2. 药品与试剂
对照品二氢丹参酮I、丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA、丹参素钠、丹酚酸B、丹酚酸A购于成都普思生物科技有限公司。批号分别是PS010172、PS010103、PS010099、PS000274、PS000269、PS000278、PS011276。乙腈、磷酸和甲醇为色谱纯，其余为分析纯。水为超纯水。
2.3. 丹参饮片的制备
丹参药材鲜品采自于四川川丹参道地产区，为栽培第二年生植株，由西南科技大学植物学教授马林进行鉴定，结果为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的根及根茎。试验材料按下述方法制备。
2.3.1. 加工炮制一体化丹参饮片
借鉴陆小华 [6] 的方法，经过实验改进，按下列步骤生产：1) 丹参鲜品采收后，分拣直径在1 cm以上和0.5~1 cm的根；2) 抢水洗3~5分钟；3) 取出在30℃下鼓风干燥至含水量35%~40%，取出切成3 mm厚薄片；4) 再在30℃下鼓风干燥至含水量在10%以下。
2.3.2. 传统丹参饮片
按照2015版药典方法 [1]，在实验中细化各操作步骤，按下列程序进行：1) 丹参鲜品采收后，去泥沙，阴干。2) 取丹参药材干品，洗净，码放成堆，用纯净水喷淋5次，时间间隔每次2.5 h，喷水量控制在药材质量的1/5，用湿润纱布覆盖，让丹参原药材吸收水分至含水量35%左右，浸润10 h，取出，切成3 mm厚片，50℃度热风干燥。
3. 方法与结果
3.1. 丹参酮类成分的含量测定
借鉴杨树生 [7] 等的方法，在试验中改进，方法如下。
3.1.1. 色谱条件与系统适应性条件
色谱柱为Welch C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇：水(70:30)；等度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长270 nm；柱温25℃；进样体积为10 μL。
3.1.2. 溶液的制备
对照品溶液的制备：精密称取，丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I对照品各10 mg，用甲醇制成丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I分别为0.1 mg/ml、0.08 mg/ml、0.1 mg/ml、0.1 mg/ml的丹参酮类混合对照品溶液。供试品溶液的制备：取丹参样品粉末约0.3 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇，密塞，称定重量，超声处理45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，再用微孔滤膜(孔径0.45 μm，下同)滤过，即得供试品溶液。
3.1.3. 样品测定
按3.1.1项下色谱条件，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪测定，即得。
3.2. 丹酚酸类成分的含量测定
参考张友芹 [8] 等的方法，在试验中改进，方法如下。
3.2.1. 色谱条件与系统适应性条件
色谱柱为Welch C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇：乙腈(10:1) (A)，1%甲酸(B)；梯度洗脱(0~5 min，30%的流动相B；5~6 min，30%~45%的流动相B；6~20 min，45%的流动相B；20~22 min，45%~30%的流动相B；22~25 min，30%的流动相B)；流速1.0 ml/min；检测波长280 nm；柱温40℃；进样体积为10 μL。
3.2.2. 溶液的制备
对照品溶液的制备：取丹酚酸B、丹酚酸A和丹参素钠对照品，精密称定10 mg，加甲醇–水(8:2)混合溶液制成丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠均为0.1 mg/ml的丹酚酸类混合对照品溶液，即得。供试品溶液的制备：取丹参样品粉末约0.15 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 ml甲醇–水(8:2)混合溶液，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇–水(8:2)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，移至10 ml量瓶中，加甲醇–水(8:2)混合溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
3.2.3. 样品测定
按3.2.1项下色谱条件，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入液相色谱仪测定，即得。
3.3. 方法学验证
3.3.1. 线性关系考察
丹参酮类成分的线性关系考察：精密吸取二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮IIA混合对照品液，加甲醇分别配制二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮IIA浓度为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml，丹参酮I浓度为0.8、4.0、8.0、12.0、16.0 μg/ml的混合标准品溶液，按2.1项下色谱条件，精密吸取不同浓度的混合标准品溶液各进样10 μl，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，含量为横坐标绘制标准曲线。丹酚酸类的线性关系考察：用甲醇–水(8:2)混合溶液分别配置丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠均为1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μg/ml的混合标准品溶液，按照2.2项下色谱条件精密吸取不同浓度的混合标准品溶液各进样10 μl，测定峰面积，以峰面积值为纵坐标，含量为横坐标绘制标准曲线。
得到的7种成分线性回归方程见表1。
Table 1. Regression equation and linear range of components
表1. 各成分的回归方程及线性范围
3.3.2. 精密度试验
丹参酮类成分的精密度试验：精密吸取丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I混合对照品溶液10 μl，按3.1项下含量测定方法，重复进样6次，计算RSD；结果分别为0.51%、0.69%、0.75%、0.62%。丹酚酸类成分的精密度试验：精密吸取丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素钠混合对照品溶液10 μl，按3.2项下含量测定方法，重复进样6次，计算RSD；结果分别是：0.71%、0.58%、0.81%。结果表明精密度试验符合要求。
3.3.3. 稳定性试验
丹参酮类成分稳定性试验：取同一供试品溶液，按3.1项下含量测定方法测定分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样，测定含量，计算RSD，验证24 h内供试品溶液中丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量的稳定性，结果是1.21%、2.05%、1.54%、1.32%。丹酚酸类的稳定性试验：取同一供试品溶液，按3.3.3项下含量测定方法测定分别于0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h进样，测定含量，计算RSD，验证24 h内供试品溶液中丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素的含量的稳定性，结果为2.29%、1.69%、1.61%。
3.3.4. 重复性试验
丹参酮类成分的重复性试验：精密称取6份同一丹参样品粉末，按3.1项下方法制备6组供试品溶液，再按照按3.1项下含量测定方法测定，计算RSD，结果是1.86%、2.12%、1.76%、1.98%。丹酚酸类成分的重复性试验：精密称取6份同一丹参样品粉末，按2. 2项下方法制备6组供试品溶液，再按照按3.2项下含量测定方法测定，计算RSD，结果为1.85%、1.56%、2.06%。
3.3.5. 加样回收率试验
丹参酮类成分的重复性试验：取已知4种丹参酮成分含量的丹参供试品溶液6份，分别精确加入与样品中的含量相等的丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I对照品溶液，按照3.1项下含量测定方法测定含量，得到丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的加样回收率(RSD值)分别为99.85% (1.59%)、100.5% (1.68%)、101.2% (2.25%)、98.24% (1.82%)。丹酚酸类成分的加样回收率试验：取己知含量的丹参样品粉末0.15 g (6份)，精密称定，分别精密加入样品含量的100%的丹酚酸A、丹酚酸B和丹参素标准品，按3.2项下方法制备溶液和测定方法测定，计算回收率和RSD，结果分别是96.82% (1.23%)、101.2% (2.06%)、98.67% (2.43%)。两类成分的回收率数据均满足加样回收率要求(95%~105%)，且RSD值均较低，表明加样回收率试验结果符合相关规定要求。
3.4. 含量测定
3.4.1. 色谱条件与系统适用性
本试验的色谱条件与系统适用性结果如图1和图2。
Figure 1. HPLC diagrams of tanshinones mixed reference substance (a) and tanshinone test substance (b). (1, dihydrotanshinone I; 2, tanshinone I; 3, cryptotanshinone; 4, tanshinone II A)
图1. 丹参酮类成分的混合对照品(a)和丹参供试品(b)的HPLC图。(1，二氢丹参酮I；2，丹参酮I；3，隐丹参酮；4，丹参酮IIA)
Figure 2. HPLC diagrams of salvianolic acids mixed reference substance (a) and salvianolic acids test substance (b). (1, danshensu; 2, salvianolic acid B; 3, salvianolic acid A)
图2. 丹酚酸类的混合对照品(a)和丹参供试品(b)的HPLC图。(1，丹参素；2，丹酚酸B；3，丹酚酸A)
由图1和图2可以看出，丹参酮类和丹酚酸类的混合对照品和供试品图中。的各峰都被分离开来，分离度高，且峰形良好，表明两种色谱条件的系统适用性良好。
3.4.2. 含量测定
将两种方法制成的丹参饮片制备溶液，按本试验的测定方法测定7种丹参酮类和丹酚酸类成分的含量。结果见表2。
Table 2. Compositions content of two types of processing methods of SMRR in Sichuan (n = 6)
表2. 两种方法炮制的川丹参饮片化学成分测定结果(n = 6)
从表2中的试验结果可知，两种方法炮制的丹参饮片相比，工炮制一体化丹参饮片的丹参酮IIA、丹参酮I、隐丹参酮、二氢丹参酮I的含量分别高出18.22%、24.39%、2.38%和15.55%，丹参酮类成分含量的总和高出16.66%；丹酚酸A、丹酚酸B和丹参素的含量分别高出15.16%、37.50%、9.09%，丹酚酸类成分含量的总和高出15.24%；表明加工炮制一体化法炮制的丹参饮片质量较好。
4. 讨论
在预试验时，对混合对照品溶液中丹参酮类和丹酚酸类的分离、检测进行了流动相的考察，结果表明，丹参酮类用流动相为甲醇:水(70:30)；等度洗脱，分离得到的色谱峰多，可获得良好的分离效果；丹酚酸类成分用流动相为甲醇:乙腈(10:1) (A)，1%甲酸(B)；梯度洗脱(0~5 min，30%的流动相B；5~6 min，30%~45%的流动相B；6~20 min，45%的流动相B；20~22 min，45%~30%的流动相B；22~25 min，30%的流动相B)，效果好。
丹参加工炮制过程中，去泥沙等杂质是重要的环节。《中国药典》2015版规定：药材采收要去泥沙、干燥，丹参饮片炮制时，要除去杂质，洗净、润透、切片、干燥 [1]。在实际生产中，有两种选择：一是采收时，趁鲜品水洗去泥沙等杂质，然后干燥，之后炮制时，再洗净，干燥，这个过程进行了两次水洗，两次干燥，在此过程中不可避免会造成有效成分损失和变化；二是选择采收时，边干燥，边搓揉，除去泥沙，这样药材中含泥沙杂质多，粘在丹参药材表面，在炮制时，洗净环节用时间长，有效成分损失大。
梁君、李帅锋、罗明华等 [9] [10] [11] 研究半夏、何首乌和川白芍饮片炮制加工时，缩短水洗时间，显著提高了其饮片有效成分的含量，本试验中趁鲜品，进行抢水洗，已得到类似结果。
丹参炮制过程中，干燥温度的选择是关键的因素之一，高温干燥导致有效成分变化 [12] 和损失，喻芳君等 [13] [14] [15] 研究得出：鲜丹参50℃~70℃烘干可使丹参酮类成分损失14.9%~23.9%，丹酚酸B损失18.7%~32.9%，本试验在前期研究中进行条件筛选时，已得出了相似的结论，因而在干燥时采取低温(30℃烘干)鼓风干燥。
本试验结果表明，与传统丹参饮片相比，产地加工炮制一体化丹参饮片7种成分含量的总和高，饮片质量较好，说明此工艺技术可以减少有效化学成分损失，提高饮片质量。本研究结果为川丹参饮片炮制的一体化生产模式的建立提供了科学依据，为进一步推广应用提供参考。
基金项目
德阳市开放式校市合作技术研发项目(编号：2018CKJ025)；绵阳师范学院科研项目(编号：07134213)。