1. 引言
掌叶木[Handeliodendron bodinieri (Levl.) Rehd]，无患子科掌叶木属植物，落叶乔木或灌木。因树叶酷似鸭掌，当地村民俗称鸭脚板，为第三纪孑遗古老植物，喀斯特地区特有树种之一，对研究植物区系和无患子科的系统发育具有科学价值 [1] [2] [3]。1984年，中国科学院植物研究所发布的《中国植物红皮书》中，掌叶木被列为国家二级稀有濒危植物；1996年，在国务院发布的中华人民共和国野生植物保护条例》中，掌叶木被列为国家一级保护植物 [4] [5]。掌叶木是优良的能源及绿化物种，科研及经济利用价值大，是绿化石灰岩山地的优良速生树种，在茂兰保护区多分布在喀斯特山地貌中下部或沿沟谷边海拔500~900 m之间的阔叶林中 [6]。掌叶木种子因富含油脂，在自然环境下易腐烂丧失发芽能力及受松鼠、鸟类等动物觅食，再加上人为干扰破坏、生存环境特殊及自身特性的影响，在自然状态下掌叶木种子有较高的败育率，自然散播的种子萌发率极低，天然更新困难，呈现纺锤形结构，现有种群无论是在径级、高度还是在分布上，都呈衰退表型，自然更新状况极差，目前已濒临灭绝 [7] [8] [9] [10]。目前，国内外学者对掌叶木的研究多在形态特征、群落生态学特征、种子生殖特征、遗传多样性、分布区和个体生长等方面 [11] [12] [13]，但对掌叶木的离体培养方面的研究甚少。因此，本研究对掌叶木种子的组织培养及快速繁殖技术进行研究和探讨，以掌叶木种子为外植体，通过组织培养试验提高种子萌发率，以期为无患子科植物的组织培养技术提供科学依据和理论指导，为人工繁育及解决掌叶木种子难萌发的问题提供可靠技术依据。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料及消毒处理
掌叶木种子采自贵州茂兰国家级自然保护区。2018年8月底至10月初采集成熟果实，果实采下后选出饱满蒴果，阴干待果实裂开，取出种子，用少量洗衣粉水或肥皂水清洗油渍，轻轻揉搓去除假种皮，再用小毛刷充分刷洗干净，用84消毒溶液浸泡5分钟，用滤纸吸干表面水分，将洗净种子置于无菌的烧杯中。消毒时在超净台上操作，在超净工作台用 75%酒精表面消毒5 min，以无菌水冲洗3~5次，再用次氯酸钠(10%)浸泡消毒了15~20 min，消毒时要不断搅动，使种子与消毒剂充分接触，最后用无菌水清洗4~5次后去除掌叶木黑色假种皮，剥开种子接到添加附加物的无菌培养基上。试验所用的试剂和植物激素均为分析纯 [14]。
2.2. 试验方法
2.2.1. 培养基配制及培养条件
按照MS培养基配方计算用量配制培养基。在容器中加入2.0%蔗糖，0.4%琼脂，10%香蕉及适量蒸馏水加热搅拌均匀，根据计算比例依次加入大量元素、微量元素、铁盐、不同种类、不同浓度的生长调节激素(植物生长素α-NAA、IBA、2.4-D及细胞分裂素6-BA、KT)，加水定容。调节pH值，使PH为5.8~6.2。初代培养基配方见表1，掌叶木愈伤组织诱导结果见图1。各培养基进行3次以上重复试验，每次50个母瓶以上，培养温度26℃ ± 3℃，光照强度2000 lx，光照时间12 h/d，每隔7 d进行观察记录，30 d后统计分析培养情况 [15]。
Table 1. Proportion of growth regulating hormones with different concentrations
表1. 不同浓度的生长调节激素配比
Figure 1. Induction of callus in palm-leaf wood
图1. 掌叶木愈伤组织诱导结果
2.2.2. 污染率计算及从芽统计
接种后定期进行观察，统计污染、褐化及无菌活体母瓶数量，并计算百分比。其中无菌活体得率 = (接种数 − 污染数 − 褐化数)/接种数 × 100%，污染率 = 污染数/接种数 × 100%。30 d后观察各培养基中愈伤组织的数量、出愈天数以及诱导率，并观察其生长势。诱导率 = 出愈数/无菌活体数 × 100%。30 d后对生长状态良好、个体差异小、高大于4 cm、粗大于0.3 cm的苗进行丛芽诱导。将苗切成带有腋芽或顶芽的茎段，转入继代培养基中诱导丛芽，每个配方接种50个茎段，1周为一个培养周期，观察记录丛芽诱导情况，统计丛芽增殖倍数 [14]。
2.2.3. 玻璃化抑制处理
掌叶木种子经常规消毒后接种到培养基中后均能生长，但丛芽增殖培养过程中易产生玻璃化现象。以诱导出的愈伤组织(从芽)为实验材料，将MS培养基换为B5培养基，从培养基类型、生长调节剂、糖含量三方面进行调节。
3. 结果与分析
3.1. 无菌活体得率
掌叶木种子现采现培养用清洁剂及毛刷清洗油渍，超净工作台上用75%酒精表面消毒3~5 min，无菌水冲洗3~5次，再用次氯酸钠(10%)浸泡消毒了15~20 min，无菌水清洗4~5次后去除假种皮接种，可以获得85%左右的无菌活体。掌叶木外植体种子接种到添加诱导激素的培养基上培养10 d后，种子表面开始膨大形成肉眼可见的愈伤组织。
3.2. 愈伤组织诱导结果
在添加不同激素培养基的诱导处理下，愈伤组织的诱导结果具有明显差异性(表2)。不同培养基诱导出愈伤组织的时间、颜色、生长情况、诱导率有明显不同。培养基中分别加入不同浓度的生长调节剂2.4-D，IBA、α-NAA，加入不同浓度细胞分裂素6-BA，KT对种子萌芽与生长有较大影响。从表3可看出，α-NAA较2.4-D和IBA好，6-BA较KT效果稍微好些。另外，通过实验发现，生长素含量均小于细胞分裂素含量有利于愈伤组织的诱导生长，总激素含量应在1.5 mg/L以下。通过筛选，6号配方即MS + 6-BA 1.0 mg/L + α-NAA 0.5 mg/L较适合掌叶木愈伤组织的诱导。其诱导率为92%，诱导期为12 d。愈伤组织为黄绿色，生长状态最好。
Table 2. Effect of different hormone medium on callus induction
表2. 不同激素培养基诱导愈伤组织结果
3.3. 丛生芽诱导
将愈伤组织在无菌条件下剪切，转接到不同激素配比的丛生芽诱导培养基中，20 d后愈伤组织上可见小芽点分化出来。30 d后小芽点伸长成为丛生芽。掌叶木继代培养结果：随着6-BA用量从1~2.0 mg/L逐渐增大，丛芽生长情况逐渐变差，甚至变黄，BA用量应控制在1.0 mg/L以下。α-NAA用量从1~2.0 mg/L逐渐增大，丛芽生长状态差，故NAA用量宜在1.0 mg/L以下，较适合丛芽增殖的培养基即：1/2MS + 6-BA0.5 mg/L + α-NAA 0.25 mg/L，该配方可诱导产生生长状态良好、增值倍数为3~4的丛芽。
3.4. 玻璃化抑制的处理结果
丛芽继代培养产生易断、畸形、透明状、叶片易脱落等玻璃化苗，严重影响了丛芽的质量和增值倍数。以B5培养基代替MS培养基，将大量元素降为原用量的1/2，能有效地抑制愈伤组织的玻璃化，生长可恢复正常。从表3可看出，1.0 mg/L 2.4-D + 0.5 mg/L KT利于愈伤组织玻璃化现象的改善。玻璃化逆转率与KT用量成负相关。各因素兼顾增殖倍数与玻璃化逆转率的最佳水平组合为：1/2 B5 + KT0.5 mg/L + 2.4-D 1.0 mg/L。
Table 3. Effects of different KT concentrations on glassy treatment
表3. 不同KT浓度抗玻璃化处理效果
4. 结论
掌叶木作为国家一级保护植物，目前已经成为濒危树种．组织培养难度较大。通过大量试验，结果表明，6-BA 1.0 mg/L + α-NAA 0.5 mg/L较适合掌叶木愈伤组织的诱导；6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.25 mg/L较适合掌叶木愈伤组织的增值。KT 0.5 mg/L + 2.4-D 1.0 mg/L利于愈伤组织玻璃化现象的改善。
基金项目
贵州省林业厅青年专项基金(黔林科合J字【2015】18号)-掌叶木种子雨动态研究。