1. 引言
益生菌(probiotics)在全球由成千上萬的科研团队研究下，接二连三地被发现、被开发、被验证其机能性并广受肯定。至今，最新的研究进一步显示益生菌对于脑部调控具有密切的关连性，其由Logan及katzman在2005年首次提出了益生菌可能与忧郁症具有关联性的论述 [1]。后来在Barrett进一步的提出了具有改善短链脂肪酸浓度而减缓精神相关压力所引起的肠胃道敏感性腹泻的潜力 [2] 重此开启了益生菌用于脑部代谢相关研究的新蓝海。
综合多年研究的积累，于2013年Timothy G. Dinan [3] 提出了精神益生菌(Psychobiotics)的定义，被认为精神益生菌是一种新机能性益生菌，具有产生或影响具有神经传导活性之功能，透过这些物质能影响肠–脑之间的双向沟通，不再是单向传递讯息。因双向沟通而经由肠道影响脑部活性，进而产生类似抗忧郁或焦虑的机能性。
菌–脑–肠轴线是现在精神益生菌研究的理论基础，目前肠道菌数量比人体细胞总数多了一倍，但肠道菌调控基因总数比人体增多了150倍以上！是个非常复杂与难解的微生物菌相生态圈。随着神经科学的研究，更发现肠道周遭除了免疫细胞之肠道免疫外，更是含有充沛与复杂的神经系统，超过一亿个以上神经细胞，散布在肠道周遭。因此在1999年，Michael [4] 即提出了第二大脑的概念，认为肠道因具有大量神经细胞，因此具有独自思考、感觉、学习及记忆的功能性。近年来，更因肠道中富含的菌相及基因产生了，各种神经传导物质因此可反馈影响大脑的活性，因此菌–肠–脑轴线的概念就此产生 [5] [6] [7] [8]。
在菌肠脑轴线中，负责联系沟通的物质即是神经活性船讨物质，具有神经传导活性的物质被定义为：1) 于神经元内被制造出来；2) 该神经活性物质在神经元内储存；3) 可被刺激而释放，进行神经细胞间的讯息传递；4) 具有回收机制或在体内可被分解而改变活性；5) 可被人工调节，产生之生物效应影响神经细胞活性。
目前跟肠道有关的神经活性物质大致可分为三大类：
1) 单胺类(monoamine)：如多巴胺(dopamine、DA)、血清素(Serotonin、5-HT)、正肾上腺素(noradrenaline、NA)、肾上腺素(epinephrine)、及退黑激素(melatonin)。
2) 胺基酸类：如胺基丁酸(γ-aminobutyric acid、GABA)、麸胺酸(glutamate)、丝胺酸(serine)及天门冬胺酸(aspartate)。
3) 其他类如：乙酰胆碱(acetlycholine)、一氧化氮(nitric oxide)及组织胺(histamine)等等。
神经传导物质过多或过少都可能产生失调现象，最常见的神经传导物质中，以血清素、多巴胺及正肾上腺素为代表：
1) 血清素：使人产生满足感的重要贺尔蒙，浓度不足时，容易产生焦虑或情绪低落等等的行为表现。
2) 多巴胺：为脑部维持活动力的关键贺尔蒙，使人散发热情与活动力，浓度低时，容易产生丧志等特性，浓度高时却又容易较为亢奋甚至癫痫等副作用。
3) 正肾上腺素：具有振奋人心的关键贺尔蒙，通常处于高压紧张状态下容易提升正肾上腺素浓度，但久易导致中枢神经或心血管相关病变。
肠道表面树突中的神经细胞与肠道细胞存在着交互作用关系，受到肠内菌相引起的免疫系统调控 [9]，能防止细菌在肠道引起发炎或感染等等相关疾病。另一方面指出，树突细胞受到肠道细胞所调控之免疫系统细胞激素所影响 [10]，能够通过细胞激素调节肠道神经，分泌上述多种神经传导物质。
因此推论益生菌透过脑–肠–调控之可能性为：1) 益生菌分泌相关神经传导物质或脑源性滋养因子；2) 调控肠道附近神经；3) 保护肠道黏膜完整性，降低肠漏现象；4) 调控肠道黏膜免疫系统。
从脑部开始调控改变肠道菌项之可能性为：1) 影响肠道黏膜细胞活性；2) 调控肠道蠕动；3) 影响肠道通道性；4) 调控免疫系统。
目前研究推论为的关键在于迷走神经(vagus nerve)，其负责联系菌–肠–脑轴线之反应，主要原因是迷走神经具有大脑与肠道双向沟通之特性，在肠道中更可受到肠内菌之内毒素、肿瘤坏死因子-α及IL-1β等等细胞激素之影响，这些关键性细胞激素，在肠道中具有调控发炎或抑制发炎等等的相关机能性，因而经由迷走神经反向联系脑部，进而改变ENS-CNS双向神经讯息 [11]。
因此可进一步的运用动物实验模式，给予刺激伤害后，诱导实验鼠产生类忧郁或类焦躁行为，改变神经系统中的神经传导物质浓度改变而产生动物行为上的偏差，藉此由精神益生菌的介入或预防，进行实验鼠的治疗或改善特性分析，以用来开发效果更显着之精神益生菌。
2. 材料与方法
2.1. 实验菌株
经体外细胞实验与动物实验筛选具有降低发炎因子之菌株，可调控发炎相关细胞激素之益生菌进行下列实验。
1) 植物乳杆菌GKM3：自传统发酵泡菜分离筛选获得，经16SrRNA鉴定为发酵乳杆菌并寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CGMCC NO.14565。
2) 罗伊氏乳杆菌GKR1：自婴儿粪便检体中分离筛选获得，经16SrRNA鉴定为发酵乳杆菌并寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CGMCC NO.15201。
3) 发酵乳杆菌GKF3：自传统发酵泡菜分离筛选获得，经16SrRNA鉴定为发酵乳杆菌并寄存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号：CGMCC NO.15203。
4) 市售品分离植物乳杆菌PS株：市售多国专利具有神经调节机能性之益生菌株，经16SrRNA鉴定确认为植物乳杆菌，以进行对照组设定使用。
2.2. 益生菌冻干粉末制备
实验所用从−80℃冷冻库中取出保存管，经37℃水浴退冰后，在无菌操作台中，菌液经四分画线分离于MRS agar平板后反置，经过37℃ 40~48小时培养后，挑取单一菌落于各别培养于1 L MRS培养基中，经 37℃、16小时静置培养后，以5000 RPM、25℃、离心10分钟取得菌泥，混入菌泥重量相当之20%脱脂乳粉水溶液后冷冻干燥而得。冷冻干燥研磨过筛20目之粉末，调整菌数为1 × 1011 cfu/g保存于−20℃备用。
2.3. 试验动物与饲养
本次试验遵守动物伦理委员会3R规范，以八周大SPF 级 ICR小白鼠进行试验，体重介于20~25 g之雄性小白鼠经一周稳定其后进行六周的实验饲养。动物房温度控制在23℃ ± 2℃，湿度控制在60%~80%，光照与黑暗各十二小时(07:00~19:00为光照期；19:00~07:00为黑暗期)。
2.4. 样品分析试剂
1) 血清素(5-HT) ELISA 套组：BioVision, Inc. Milpitas, CA。
2) 多巴胺(DA) ELISA 套组：BioVision, Inc. Milpitas, CA。
2.5. 实验流程
ICR小鼠经过7天适应期之后随机分为五组，造症组每日喂食0.85%食盐水100 μL/mice，其余四组每组分别喂食不同乳酸菌样品，乳酸菌喂食剂量为1.0 × 109 cfu/mice，连续14天。经过14天喂食后开始，开始进行类忧郁模式造症。每只小鼠禁锢于30 mm × 100 mm之小鼠抽血固定器中，每天禁锢2小时并每日喂食试验物。连续禁锢14天后牺牲，随即取出脑部组织，并以液态氮冻结后研磨均质化，所得之脑部组织保存于−80℃冰箱中，再以商业套组ELISA进行脑部组织中，多巴胺(DA)与血清素(5-HT)含量分析。
2.6. 统计分析
统计分析实验数据使用SPSS计算机统计软件进行分析。变异数分析则以PROC ANOVA与Duncan’s multiple range test进行分析，p < 0.05为具有显着性差异。
3. 结果
3.1. 多巴胺含量分析
经过类忧郁症试验后可以发现三株乳酸菌对于小鼠脑内多巴胺浓度具有不同程度的调控性，如图1所示。每日喂食GKF3发酵乳杆菌之小鼠脑内具有最高浓度的多巴胺，证明在禁锢试验中，GKF3发酵乳杆菌可以有效地的刺激性脑内多巴胺分泌，维持多巴胺浓度，对于外在因素破坏脑内多巴胺浓度具有最佳保护性，其多巴胺浓度达到统计上的差异，与造症组相比提高了27%，效果显着。其次佳者为GKR1罗伊氏杆菌，GKR1益生菌株在本次试验中，具有提升多巴胺15%之结果且达统计差异(P < 0.05)略差于GKF3株。在先前试验中，具有消炎能力极佳之GKM3植物乳杆菌株则无显着差异，但是市售调节脑常轴线之植物乳杆菌PS株，在本试验中也被证实具有提升脑内多巴胺的能力，效果与GKF3相当，两者间无显着差异，证实乳酸菌对于脑内多巴胺调控具有显着的差异性且其中存在着菌株的差别，不同株之间植物乳杆菌同时存在着菌株间的差异。
Figure 1. The concentration analysis of the dopamine in brain of mice which use probiotics to anti-depression like symptoms
图1. 乳酸菌株用于预防类忧郁症老鼠试验中，小鼠脑内多巴胺浓度分析
3.2. 血清素浓度分析
在血清素分析的方面发现，GKF3发酵乳杆菌组具有最高的血清素浓度，经图2的结果可发现，浓度可达21 ng/mg，较造症组11 ng增加了90%，具有十分显着的提高，并达到统计上的差异性(P < 0.01)。再次高组中，可发现GKR1及PS株同样具有显着的血清素刺激性，可以刺激血清素浓度达到13 ng/mg，对比造症组18%的增加。但是GKM3植物乳杆菌则无差异。
Figure 2. The concentration analysis of the serotonin in brain of mice which use probiotics to anti-depression like symptoms
图2. 乳酸菌株用于预防类忧郁症老鼠试验中，小鼠脑内血清素浓度分析
4. 讨论
根据世界卫生组织评估，忧郁症将成为全球导致人类失能疾病的第二位。当全球化的影响，社会环境变迁加速，人们面临工作压力或是生活上家庭上的变故，将更易产生忧郁的情绪，如同遭禁锢的老鼠般，易因为内分泌或细胞激素受到压力影响而导致罹患忧郁症的风险增加。此现象的发生被认为与脑内神经传导物质浓度愈有密切关连性。具有神经传导活性物质主要可在神经系统中被传递、储存或代谢而进行神经细胞间的讯息传递与维护正常机能。目前医学上针对忧郁症患者药物治疗的角度往往锁定于补充神经传导物质、抑制神经传导物质被代谢或较不易被代谢且具有相同活性知之结构物，以达到提高神经传导方面的活性。但这些方法往往效果较为不佳，也因此迫切地寻找是否更安全且有效的方法来进行脑部神经传讨方面异常之改善方式。
脑内具有神经传讨因子之活性物质可分为三类：1) 单胺类：如多巴胺、血清素、正肾上腺素等；2) 胺基酸类：胺基丁酸、麸胺酸、丝胺酸等等；3) 其他类如：乙酰胆碱、一氧化氮及组织胺等等。脑内神经传导物质若以摄取的方式补充，绝大多数因无法通过大脑屏障而无法呈现活性，因此往往导致口服或静脉注射无效。因此藉由给予刺激物的方式，提高自体神经传导活性物质浓度，是目前认为效益较佳的方式。
精神益生菌被认为可以有效提升单胺类神经传导物质，因此在本实验中，我们锁定多巴胺与血清素作为评估的依据，在图1脑内多巴胺及图2血清素浓度的结果显示了，禁锢所产生的类忧郁诱导行为，对实验鼠脑内与忧郁症密切相关的神经传导物产生实质且显著的调降，而这些忧郁的现象，可藉由精神益生菌的补充，而得到了缓解改善，证实了来自肠道的回馈控制讯号——也就是脑肠轴线的调控 [12] [13]，随着科学对肠道的了解，许多单胺类神经传导物质可由肠道中所合成 [14]，合成后的神经传导物质藉由肠道周遭的迷走神经负责联系脑部，因此过度活耀的肠道或脑部，都将互相影响。最典型的脑部压力影响肠胃道的案例即是紧张、压力所引起的肠躁症 [15]。在这次的实验中，我们假设环境因素引起肠炎而导致脑部贺尔蒙的变化，故挑选具抗发炎机能性之菌株，经由禁锢的方式，使的小鼠产生类忧郁症。在实验中可以发现摄取GKF3发酵乳杆菌具有显着提升单胺类神经传导物质血清素及多巴胺的效果，在多巴胺的浓度方面与据有神经调节之菌株PS株效果类似，但是在血清素方面，则GKF3及PS株具有显着的差异，这个结果告诉了我们多巴胺与血清素之间，并无绝对正相关的关系，两者菌株之间GKF3针对血清素的刺激性更佳。若以多巴胺为考虑，则两者无差异，但是若希望以血清素为指标的提升，GKF3株将优于PS株。植物乳杆菌GKM3在血清素测试中几乎无异于造症组，证实了刺激脑部贺尔蒙变化的脑肠轴线与免疫系统调节路径具有差异，提升脑中或肠道中血清素有助于体内发炎的调控，但是发炎反应的调节与血清素的调控无绝对相关 [16]。精神益生菌的筛选与开发工作将随着文明的发展、社会的进步而更显重要，如何进一步筛选找寻具有更佳脑部神经活性调节之机能性。在初步成功筛选具有大幅度提升脑内单胺类之后，下一步将持续重复筛选及进行忧郁症行为模式改善评估与下一阶段的临床人体试验评估，期待能找寻显着且有效的脑部益生菌。