1. 引言
芬太尼属于强效合成阿片类物质，临床上常被用作镇痛剂和麻醉剂 [1]。与传统毒品相比，芬太尼类物质作用更强，依赖性更强，且致死量小，具有极高的滥用风险 [2] - [7]。从20世纪80年代开始，出现了芬太尼类似物的秘密和非法合成事件，而且新型芬太尼类似物不断出现，这对公众健康和安全构成重大威胁 [8] [9] [10] [11]。我国于2013年对奥芬太尼进行了列管 [12] [13]，奥芬太尼分子式为C22H27FN2O2，结构式见图1。
Figure 1. Molecular structural formula of ocfentanil
图1. 奥芬太尼的化学结构
由于生物检材中毒品代谢产物的检出是吸毒行为认定或毒品中毒死亡认定的重要依据 [14]，而目前国内对奥芬太尼的检测研究较多 [6] [15] [16] [17] [18] [19]，但对其代谢产物的研究较少，因此，确定奥芬太尼在体内的代谢途径和主要代谢产物，可以为生物检材中检出此类新精神活性物质提供依据。由于健康和伦理问题，难以进行体内人体代谢研究，动物实验过程复杂，耗时长，且所需新精神活性物质样品量大，也难以开展。肝微粒体体外温孵法是药物代谢研究的常用方法 [20] [21] [22]，但用于法庭科学中对毒品及新精神活性物质的代谢产物进行筛查的研究并不多见。本文采用肝微粒体体外温孵法，建立了超高效液相色谱串联高分辨飞行时间质谱法检测奥芬太尼在人肝微粒体中代谢产物及其主要代谢途径的方法，为法庭鉴定生物检材中的奥芬太尼提供潜在的代谢标志物。
2. 材料与方法
2.1. 仪器与试剂
2.1.1. 仪器
Triple TOFTM 5600液相色谱串联三重四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF/MS，美国爱博才思分析仪器公司)，密理博纯水机Milli-Q Integral 5 (德国默克密理博公司)，Allegra 64R冷冻离心浓缩仪(美国贝克曼公司)，QUINTIX65-1CN天平(十万分之一天平，赛多利斯科学仪器有限公司)，ME104/02天平(万分之一天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司)，超声波清洗器(舒美KQ500E，中国昆山市超声仪器有限公司)。
2.1.2. 试剂
奥芬太尼(1 mg∙mL−1甲醇溶液，公安部)、甲醇和乙腈(色谱纯，德国默克股份两合公司)，甲酸和甲酸铵(色谱纯，美国西格玛奥德里奇公司)，人肝微粒体(~20-Donor Pool, Mixed Gender，康宁公司，美国)，UDP-葡萄糖醛酸(UDPGA)、辅酶II (NADP+)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(PDH)和葡萄糖单内酯(D-Saccharic acid 1,4-lactone monohydrate)均购自美国西格玛奥德里奇公司，D-葡萄糖-6-磷酸二钠盐(G-6-P)购自北京索莱宝科技有限公司，丙甲菌素购自上海源叶生物科技有限公司，氯化镁、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠均购自中国国药集团化学试剂有限公司。
2.2. 方法
2.2.1. 仪器条件
1) 色谱条件：飞诺美Phenomenex Kinetex C18色谱柱(100 × 3 mm，2.6 μm 100 Å)，柱温30℃，流速 400 μL∙min−1；进样量1 μL，A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇。梯度洗脱程序：0 min，95%A，维持2 min；2~8 min，A相由95%变为80%；8~16 min，A相比例降低为5%，随后维持2 min，18~19 min，A相恢复95%，维持3 min。
2) Q-TOF/MS质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式检测，离子源温度(TEM)：550℃，雾化气(GS1)：50 Pa，干燥气(GS2)：50 Pa，气帘气(CUR) 35 Pa，电压(IS)：5500 V，去簇电压(DP)：80 eV。扫描范围：MS1：100~800 Da，MS2：50~800 Da，破碎电压(CE)：MS1：10 eV，MS2：35 ± 20 eV，通过Analyst TF 1.7 Software获得数据。代谢物由MetabolitePilot 2.0和PeakView 2.2进行分析。
2.2.2. 奥芬太尼人肝微粒体体外温孵模型的建立
人肝微粒体温孵试验反应体系由0.1mol∙L−1 K2HPO4缓冲液(pH = 7.4)组成，其中含氯化镁5 mmol∙L−1，NADPH生成系统(0.2 mmol∙L−1辅酶II (NADP+)、1.2 U∙mL−1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(PD)和2 mmol∙L−1葡萄糖-6-磷酸(G-6-P))，葡萄糖单内酯1 mmol∙L−1，UDP-葡萄糖醛酸(UDPGA) 2mmol∙L−1和奥芬太尼(甲醇溶液，1 mM，加样5 μL至250 μL体系中，终浓度约为20 μM)，肝微粒体蛋白的浓度为0.5 mg∙mL−1，反应体系的终体积为0.25 mL。其中，空白对照组不含药物，以反应0 h的样品作为阴性对照。
实验过程中，先将微粒体温孵体系与丙甲菌素(25 μg/mg protein)混合后，置于4℃条件下反应20 min，以缩短UGTs活性的延迟。再按上述顺序依次加入所需试剂，预温孵5 min后，加入NADPH生成系统和UDPGA启动代谢反应。所有的反应均在37℃进行。1 h后加入1 mL冰乙腈沉淀蛋白，振荡3 min，终止反应。13000 rpm高速离心10 min后，吸取上清1 ml，离心浓缩至干。挥干样品用200 μL甲醇复溶，涡旋3 min，13000 rpm离心10 min两次后，吸取上清待进样。每一份样品重复2次。空白对照同时进行。
3. 结果与讨论
3.1. 奥芬太尼质谱特征解析
在2.2.1实验条件下，奥芬太尼的二级质谱如图2(a)所示，母离子为371.2127，子离子为188.1428，146.0967，134.0969，105.0705。图2(b)为其提取离子流图，出峰时间为11.472 min。推测其裂解途径如图3所示 [23]：奥芬太尼分子结构中N-苯基酰胺部分的C-N键发生α-断裂，脱去1个烷基醛，得到碎片A，而碎片A很快进一步碎裂为质荷比146.0967的B后消失。分子结构中哌啶环的N-C和C-C键断裂，碎裂为D (质荷比188.1428)、E (质荷比134.0969)和F。质荷比105.0705的离子G为苯乙基碎片。
Figure 2. Mass spectrogram (a) and extracted Ion chromatography (b) of ocfentanil
图2. 奥芬太尼的二级质谱图(a)和提取离子流图(b)
3.2. 奥芬太尼在人肝微粒体中主要代谢产物的质谱特征分析
3.2.1. 奥芬太尼在人肝微粒体中主要代谢产物
实验发现奥芬太尼在人肝微粒体体外温孵后主要通过O-去甲基化反应(图4)产生了代谢产物C21H25FN2O2(M1)，具体信息见表1。
3.2.2. 奥芬太尼主要代谢产物M1的质谱特征分析
奥芬太尼代谢物M1的二级质谱如图5(a)所示，母离子为357.1968，子离子为188.1425，146.0949，105.0703，73.0485。图5(b)为其提取离子流图，出峰时间为10.88 min。推测其裂解途径如图6所示：碎片A、B、C均与奥芬太尼所产生的碎片相同。
Figure 3. Proposed fragmentation route of ocfentanil
图3. 奥芬太尼可能的质谱裂解过程
Table 1. Main Phase I metabolites produced by ocfentanil in a model of in vitro incubation of human liver microsomes
表1. 奥芬太尼在人肝微粒体体外温孵中产生的主要代谢产物
Figure 4. The main metabolic pathway of ocfentanil
图4. 奥芬太尼的主要代谢途径
Figure 5. Mass spectrogram (a) and extracted ion chromatography (b) of the main metabolite of ocfentanil, M1
图5. 奥芬太尼主要代谢物M1的二级质谱图(a)和提取离子流图(b)
Figure 6. The proposed fragmentation route of the main metabolite of ocfentanil in UPLC-QTOF/MS
图6. 奥芬太尼主要代谢产物M1可能的质谱裂解过程
4. 结论
本文应用高分辨的液相色谱串联三重四极杆飞行时间质谱对奥芬太尼进行了检测，对其质谱特征进行了分析，确定奥芬太尼的母离子为371.2115，主要的子离子为188.1423，146.0964，134.0964，105.0705，推测奥芬太尼首先是其分子结构中N-苯基酰胺部分的C-N键发生α-断裂，脱去1个烷基醛，再进一步碎裂为质荷比146.0964的离子。同时，其哌啶环中N-C和C-C键也会发生断裂，碎裂为质荷比188.1423、质荷比134.0964的碎片。质荷比105.0705的离子为苯乙基碎片，这为推断芬太尼类物质质谱裂解规律提供了线索。
随后，本文用人肝微粒体体外温孵法进行了奥芬太尼的体外代谢实验，并对奥芬太尼的主要代谢产物M1进行了分析，结果表明奥芬太尼的主要代谢产物由O-去甲基化代谢反应生成，其分子式为C21H25FN2O2，母离子质荷比为357.1973。此结果为实际工作中筛查奥芬太尼滥用者提供了潜在的生物标志物，但仍需在以后的工作中收集真实人体尿液样本或血液样本，比对其中的主要代谢产物，才能最终确认奥芬太尼的代谢标志物，为正确认定奥芬太尼滥用行为提供参考。
NOTES
*通讯作者。