1. 引言
2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)是多病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢性疾病，是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起，随着人们的生活不断提高以及生活习惯的改变，糖尿病的发病率逐年升高。据统计，我国T2DM的发病率为10%，给人和社会造成了极大的负担，T2DM主要为葡萄糖不耐受和血管再生障碍，其中胰岛素抵抗参与了T2DM了发生、发展的整个过程，发病原因主要为遗传和饮食机构改变及运动量减少等因素 [1] [2]。目前尚不能治愈，仅仅依靠药物及调整生活方式进行调理，因此寻找一种新的治疗靶点及药物越来越受人们关注。
槐花为豆科槐属植物槐Sophora japonica L.的干燥花及花蕾，属于药食两用的一味良药，具有凉血止血，清肝泻火的功效 [3]。研究发现，槐花的化学成分主要是黄酮、皂苷及多糖类等。结合药理研究发现槐花中的黄酮类化合物如槲皮素、多糖类等化合物具有抗氧化、抗炎、降血糖血压等作用。而槐花临床上长被开发为止血药，食疗养生上开发为降血糖药品、保护肠胃药品等。其中目前较少报道的槐花抗2型糖尿病研究值得关注，韩玲玲等 [4] 人研究发现，槐花的醇提物对2型糖尿病小鼠的胰岛素和肝糖原等指标进行检测发现具有明显的改善作用。张伟云等 [5] 人研究发现，槐花的醇提物可改善2型糖尿病小鼠的血糖，改善口服葡萄糖的糖耐量。这些实验证据均充分说明槐花在改善2型糖尿病中具有一定的潜力，但对于改善2型糖尿病的靶点及作用机制尚不明确。
2. 材料与方法
2.1. 化学成分的建立
通过TCMSP数据库，检索“槐花”所有的化学成分，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件，此条件下默认为该化合物为活性成分，筛选出槐花的活性成分及作用靶点，并通过UniProt数据库将靶点的蛋白名转化成基因名格式，最终建立成分靶点数据集。
2.2. 靶点的筛选与建立
进入GeneCards数据库，以“Type 2 diabetes”为关键词筛选与2型糖尿病相关的基因靶点，将疾病靶点和药物靶点共同导入Venny2.1 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中，建立疾病–药物共用靶点数据集。
2.3. 关键靶点PPI网络构建
为了明确槐花治疗2型糖尿病靶点之间的相互作用，将筛选出的靶点导入String (https://string-db.org/)中，设置种类为“Homo sapiens (人类)”构建靶点互作网络图(PPI)，置信度为0.9，隐藏网络中离散点，将结果保存为tsv文件，导入Cytoscape3.6.1中，采用其“Network Analyzer”插件进行分析，确定槐花抗2型糖尿病核心的靶点。
2.4. GO生物过程富集分析和KEGG信号通路
将疾病–药物共有靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中进行GO生物过程富集分析和KEGG信号通路分析，结果以气泡图的形式进行展示。
2.5. 药物成分与靶点分子对接
JUN的晶体结构(ID: 1a02)、TP53的晶体结构(ID: 4agq)、MAPK1 (ID: 4fv4)下载于RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/)，化合物通过TCMSP、PubChem进行下载，并使用Chem3D进行能量最小化，启动运行SYBYL-X 2.0软件模块中的“Dock Ligand”模块对JUN、TP53和MAPK1的晶体结构进行对接进行加氢处理、修复侧链、并选择自动寻找活性位点等。
3. 结果
3.1. 活性成分的筛选
通过检索TCMSP数据库，共得到槐花化学成分27个，以OB > 30、DL > 0.18为筛选条件，共得到活性成分6个，分别为：quercetin-3'-methyl ether (MOL005940)、N-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide (MOL005935)、kaempferol (MOL000422)、beta-sitosterol (MOL000358)、isorhamnetin (MOL000354)和quercetin (MOL000098)，潜在靶点103个，具体见表1。
Table 1. Sophora japonica L. active ingredients and target number
表1. 槐花活性成分及靶标数
3.2. 疾病和药物相关靶点的筛选
在GeneCards数据库中以“Type 2 diabetes”为关键词，检索出与2型糖尿病相关靶基因共12,272个，筛选relevance score大于10的靶点，共得到2型糖尿病相关靶基因3698个，采用Venny2.1对槐花相关靶点及2型糖尿病靶点进行维恩图绘制，见图1，得到共有靶点93个，这些靶点包括INSR、TNF、PPARG、IL6和TP53等。
Figure 1. Sophora japonica L. target of active ingredient and target of diabetes
图1. 槐花活性成分靶点与糖尿病交集靶点
3.3. 槐花抗2型糖尿病的直接作用靶点拓扑参数分析
用String数据库构建关键靶点之间的相互作用图，将槐花治疗2型糖尿病的共有靶点导入String中，得到蛋白互作网络图(如图2所示)，其中number of nodes = 93、number of edges = 184、average node degree = 3.96、avg. local clustering coefficient = 0.471、expected number of edges = 56。将结果以TSV格式导出，通过Cytoscape3.6.1获取PPI网络中拓扑参数，采用Cytoscape3.6.1插件“Network Analyzer”共有靶点的Degree、Betweenness centrality和Closeness centrality，结果发现JUN (Degree = 21)、TP53 (Degree = 15)、MAPK1 (Degree = 15)和TNF (Degree = 14)等综合排名较前，如图3所示，说明这些靶点在槐花治疗2型糖尿病中发挥着重要作用。
Figure 3. Protein interaction diagram of top ten targets
图3. 前十靶点蛋白互作图
3.4 GO生物学功能富集分析
为了进一步探讨槐花治疗2型糖尿病的多重作用机制，将93个共有靶点导入David中进行GO富集分析，共得到GO生物学富集结果330条。其中前3位的富集过程包括positive regulation of nitric oxide biosynthetic process、response to drug和positive regulation of transcription, DNA-templated。将前20条富集以气泡图的形式展示，其中圆圈的大小表示相关靶点在通路富集的多少，圆圈的颜色越深代表靶点的富集程度，如图4所示，这表明了槐花可能是通过调节这些生物过程而发挥抗2型糖尿病。
Figure 4. Bubble chart of enrichment results of GO biological function
图4. GO生物学功能富集结果气泡图
3.5. KEGG 通路分析
将93个共有靶点映射到David数据库中进行KEGG通路富集分析，将物种定义为“人类”，共得到信号通路110条。通过筛选槐花KEGG富集结果显著性较强的前20条信号通路进行展示，这些通路与槐花抗2型糖尿病的作用机制密切相关，如图5所示。其中前5条通路包括pathways in cancer、HIF-1 signaling pathway、Chagas disease (American trypanosomiasis)、TNF signaling pathway和Bladder cancer等，这些通路大多与JUN、IL6、TP53和EGFR等有关。
为了更清晰的展现有效成分、核心靶点与通路之间的关系。利用Cytoscape3.6.1软件将槐花中的成分、共有靶点进行网络进行可视化分析，通过网络药理学构建出槐花抗2型糖尿病的交互网络，筛选出相应的交互蛋白，其中蓝色和红色均代表槐花和2型糖尿病的共有靶点，红色代表排名前30的靶点，绿色代表化学成分，共有6个，粉红色代表药物，通过构建药物–成分–靶点网络图，可更直观更清晰的看出各成分对应的靶点调控。
Figure 5. Bubble diagram of KEGG enrichment results
图5. KEGG富集结果气泡图
3.6. 分子对接结果
基于PPI网络和KEGG富集分析结果，选择槐花与2型糖尿病共有靶点综合排名较高的关键靶点(JUN、TP53和MAPK1)进行分子对接，针对这些靶点的活性成分进行分子对接验证，以总打分值(Total Score) ≥ 5为筛选条件 [6] [7] 筛选对接结果较好的化学成分，总打分值越高说明结合较为稳定。槐花相关活性成分包括quercetin-3'-methyl ether、N-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide、kaempferol、beta-sitosterol、isorhamnetin和quercetin。最后将对接结果较好的化学成分和蛋白晶体进行可视化，结果如图7所示。结合成分分子的关键靶标的氨基酸残基清晰地呈现出来，氢键用虚线表示。所有化合物的对接评分如下图8所示。结果发现，quercetin等4个化合物在抗2型糖尿病中可能发挥着重要作用。
Figure 6. Component-target-disease network diagram
图6. 化学成分–靶点–疾病网络图
Figure 7. Visualization of molecular docking
图7. 分子对接可视化
4. 讨论
网络药理学具有整体性、系统性的特点，与中医药辨证论治整体思维较为相符，为中药探索药物与疾病的相关性提供了理论指导 [8]，改变了传统研究“一个成分对一个靶点”的窘局，将化学成分–靶点–疾病组成一个包含多个体、多层次相互作用的复杂网络，这恰好与中医的多成分、多靶点、多环节的特点相吻合。本研究基于网络药理学研究方法，对槐花有效部位和活性成分进行筛选，研究其多成分–多靶点–多通路作用机制，以阐释其分子间互相作用的内涵。
槐花目前被作为药食两用的药材 [9]，具有治疗2型糖尿病的药理作用，但其作用机制尚不明确。已有研究表明，槐花中的黄酮类成分、以及kaempferol、beta-sitosterol、quercetin等具有改善2型糖尿病的作用，苗明三等 [10] 人研究发现，槐花中的黄酮类成分血清葡萄糖、胰岛素水平和C-肽水平等指标，这提示槐花中的总黄酮可能是发挥抗2型糖尿病的有效部位。汤利华 [11] 等人研究发现，槐花中的山奈酚对高糖诱导糖尿病具有较好的改善作用，能明显的改善尿素氮、血清肌酐及病理损伤等。李文雯等 [12] 人研究发现，槲皮素对糖尿病大鼠的胰岛β细胞损伤具有较好的修复作用。这些研究表明，槐花治疗2型糖尿病具有多成分，多层次的特点。
排名前三的关键靶点中的JUN (转录因子AP-1)、TP53 (细胞肿瘤抗原p53)和MAPK1 (丝裂原活化蛋白激酶1)参与了糖尿病的发生发展，如TP53可通过调节葡萄糖的转运，控制糖酵解等从而控制糖尿病的发展 [13]。JUN编码c-jun蛋白，有研究表面转录因子AP-1发生磷酸化激活后，与具有调控作用的基因启动子上在细胞核内发生特异DNA序列的结合，最终发挥调控下游基因的转录，与糖尿病的发生发展关系极为密切 [14] [15] [16]。而槐花中的槲皮素等化合物对JUN的表达具有较好的抑制作用。通过Kegg富集分析，得到前5的信号通路为pathways in cancer、HIF-1 signaling pathway、Chagas disease (American trypanosomiasis)、TNF signaling pathway和Bladder cancer。其中HIF-1 signaling pathway参与了糖尿病的调控，糖尿病因血糖的升高会使氧量增加及微循环功能障碍，最终导致微血管结构、微血流动力学改变、毛细血管基膜等结果及功能发生病变。缺氧诱导因子HIF-1调控下游功能基因表达水平，促进靶器官微血管内皮细胞增殖和微血管生成，对缺氧作出应答，从而参与糖尿病并发症的进程 [17]。
总之，通过槐花抗2型糖尿病的网络药理学研究，初步明确槐花抗2型糖尿病活性成分、关键靶点，生物过程及作用机制，可为下一步的实验验证提供参考。
基金项目
贵州省一流课程重点建设项目(黔教高发[2017] 158)。
参考文献