1. 引言
RDS和BPD是早产儿的主要肺部并发症。在极早产儿中，RDS仍然是一种严重的危及生命的呼吸道疾病。相当一部分早产儿可能伴有BPD。BPD是在炎症反应的基础上导致的肺泡及肺血管发育受损的慢性疾病，其发病机制复杂，多种原因导致肺损伤后的异常修复，往往导致长期住院，生长发育延迟，神经落后，肺功能异常等，严重影响早产儿的远期预后。维生素D是一种脂溶性类固醇生物衍生物，除对骨质矿化的重要作用外，还参与调节多种免疫细胞的生长和分化，抑制免疫调节和抗炎反应 [1]。动物和实验研究表明，维生素D对成纤维细胞增殖、表面活性剂合成、肺泡II型上皮细胞和肺泡化具有显著的积极作用。有研究认为早产儿维生素D缺乏与RDS、BPD和败血症的发生率增加可能相关 [2]，但也有研究显示，不同维生素D水平对BPD等肺部疾病无明显影响。目前早产儿添加维生素D的剂量不统一。美国儿科学会2008年指南认为，生后数日的新生婴儿即需要添加维生素D 400 IU/d [3]，欧洲儿科胃肠病、肝病和营养学会建议早产儿每天摄入800~1000 IU/d [4]。本研究动态监测极早产儿维生素D水平，并探讨维生素D对极早产儿肺部疾病的影响。
2. 研究对象与方法
2.1. 研究对象
选取2019年6月~2020年12月期间于青岛大学附属医院NICU住院符合标准的单胎极早产儿(胎龄 < 32周) 126例为研究对象。纳入研究的患儿家属对此知情同意，并取得青岛大学附属医院伦理委员会批准。
2.2. 排除标准
出生后24 h内放弃治疗，先天畸形、遗传性代谢性疾病等，未进行25-(OH)D检测。
2.3. 判定标准
出生胎龄 < 32周，出生2 h内于NICU住院，住院时间1月以上，住院资料完整。
3. 方法
3.1. 资料采集
所有符合条件的极早产儿生后24小时内测定血清25-(OH)D、ALP、血P、血Ca水平，极早产儿在喂养耐受后均给予维生素AD (维生素D 500 IU，维生素A 1500 IU)每日1粒及维生素D3 400 IU，分别于生后1月龄、2月龄时复查。所有极早产儿喂养首选母乳，母乳强化剂为统一品牌，维生素D含量为150 IU/100ml (全量强化)，75 IU/100ml (半量强化)，无法提供母乳者选用医院统一规定的早产儿配方奶，极早产儿的PN参照2013年的中国新生儿营养支持临床应用指南 [5]，脂溶性维生素中维生素D含量为400 IU/10ml (1支)。收集患儿住院期间PN持续时间、呼吸支持(机械通气、无创通气、吸氧)时间、咖啡因使用时间，RDS、早期肺动脉高压、BPD、PDA等临床资料。
3.2. 分组
根据血清25-(OH)D水平，将极早产儿分为四组。维生素D严重缺乏组：血清25-(OH)D < 10 ng/ml；缺乏组：血清25-(OH)D ≥ 10~<20 ng/ml；不足组：血清25-(OH)D ≥ 20~≤30 ng/ml；适宜组：血清25(OH) > 30 ng/ml。因该126例极早产儿出生时维生素D水平无达到30 ng/ml者，所以出生时分组分为维生素D严重缺乏组、缺乏组和不足组。
3.3. 相关诊断标准
RDS：指呼吸的室内空气时患儿血氧分压(PaO2) < 50 mmHg (6.6 kPa)，存在中央性紫绀，需吸氧才可维持PaO2 > 50 mmHg (6.6 kPa)，并伴有典型胸部X线表现 [6]。
BPD：胎龄 < 32周并具有持续性实质性肺疾病(影像学确诊为肺实质病变)的早产儿在矫正胎龄36周时连续3天内仍有赖氧现象 [7]。
BPD严重程度取决于确诊时连续3天维持动脉氧饱和度在91%~95%之间所需FiO2范围/氧气水平/氧浓度等指标，具体见表1。
Table 1. Diagnostic and grading criteria of bronchopulmonary dysplasia
表1. 支气管肺发育不良诊断及分度标准
IPPV，间歇正压通气；NCPAP，经鼻持续气道正压；NIPPV，无创正压通气。
无创通气指征：出生后出现三凹征、呼吸困难；动脉血氧分压 < 50 mmHg或经皮监测氧饱和度 < 90%，需要吸氧；呼吸暂停。
机械通气指征：频繁呼吸暂停，经药物治疗及无创通气干预无效；吸氧浓度 > 60%，动脉血氧分压< 50 mmHg或经皮监测氧饱和度 < 85% (除外紫绀型先天性心脏病)；动脉血二氧化碳分压 > 60 mmHg，伴PH < 7.20。
早期肺动脉高压：生后3~5天测得，标准：三尖瓣喷射速度下的肺动脉收缩压 > 35 mmHg，则诊断为早期肺动脉高压 [8]。超声心动图由超声科经验丰富的心脏超声科医生完成。
3.4. 统计学方法
应用SPSS 20.0软件分析处理数据分析，计量的资料首先进行正态性检验，符合正态分布的用均数 ± 标准差来表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析；不符合正态分布的用中位数M(P25, P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料用构成比(%)描述，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，相关性分析采用Spearman相关分析。结果以P < 0.05差异有统计学的意义。
4. 结果
4.1. 极早产儿的一般资料分析
本研究符合标准的单胎极早产儿共126例。其中男65例(51.59%)，女61例(48.41%)；胎龄为26~31+6周，胎龄平均(29.75 ± 1.52)周，其中胎龄 < 28周19例，28~29+6周37例，30~31+6周70例；出生体重平均(1221.58 ± 302.49) g，其中<1000 g 39例，1000 g~1499 g 65例，1500 g~1999 g 20例，>2000 g 2例；剖宫产101例(80.16%)，顺产25例(19.84%)。维生素D严重缺乏组、缺乏组、不足组间的性别、生产方式、头围身长、出生体重、胎龄无显著差别(P > 0.05)具体见表2。
Table 2. Comparison of general data of very preterm infants
表2. 极早产儿一般资料比较
注：a表示x ± s描述，统计量为F，其余以n (%)描述，统计量为χ2；*表示Fisher精确检验所得P值。
4.2. 极早产儿维生素D水平与肺部疾病关系
出生时维生素D水平与肺部疾病：RDS总发生率为95.24%，BPD总发生率为46.80%，出生时各组间RDS、BPD发生率比较差异有统计学意义(P < 0.05)，维生素D严重缺乏组发生率最高。1分钟Apger、5分钟Apger评分、咖啡因使用时间、无创通气的时间、机械通气的比率、早期肺高压、总用氧的时间、PDA和住院总时间组间比较，结果示差异无统计学的意义(P > 0.05)具体见表3。
Table 3. Relationship between different vitamin D levels and lung diseases in very preterm infants at birth
表3. 出生时极早产儿不同维生素D水平与肺部疾病关系
注：a表示x ± s描述，统计量为F，其余以n (%)描述，统计量为χ2；*表示Fisher精确检验所得P值。RDS：呼吸窘迫综合征，BPD：支气管肺发育不良，PDA：动脉导管未闭。
Spearman相关分析显示，不同维生素D水平与BPD的严重程度无明显相关性(rs = 0.005, P = 0.971)，具体见表4。
生后2月龄时维生素D水平与BPD：维生素D严重缺乏组的BPD比例明显增加，组间比较结果示，差异有统计学的意义(P < 0.05)。1月龄时、2月龄时不同维生素D分组在咖啡因使用时间、无创通气所用的时间和总用氧的时间组间比较，结果示差异无统计学的意义(P > 0.05)。具体见表5、表6。
Table 4. Correlation between different vitamin D levels and severity of BPD in very preterm infants at birth
表4. 出生时极早产儿不同维生素D水平与BPD严重程度的相关性
注：rs = 0.005，P = 0.971，BPD：支气管肺发育不良。
Table 5. Comparison of BPD in very preterm infants with different vitamin D levels at 1 month of age
表5. 1月龄时极早产儿不同维生素D水平的BPD情况比较
*表示Fisher精确检验所得P值。BPD：支气管肺发育不良。
Table 6. Comparison of BPD in very preterm infants with different vitamin D levels at 2 months of age
表6. 2月龄时极早产儿不同维生素D水平的BPD情况比较
*表示Fisher精确检验所得P值。BPD：支气管肺发育不良。
4.3. 极早产儿维生素D水平动态监测
出生时维生素D水平缺乏率达92.86%，2月龄维生素D缺乏率为53.17%。严重缺乏组出生时平均水平为7.13 ± 1.73 ng/ml，1月龄平均水平为11.39 ± 3.30 ng/ml，2月龄平均水平为16.07 ± 4.03 ng/ml；缺乏组出生时平均水平为13.42 ± 2.49 ng/ml，1月龄平均水平为17.65 ± 3.34 ng/ml，2月龄平均水平为25.99 ± 5.42 ng/ml；不足组出生时平均水平为21.79 ± 2.09 ng/ml，1月龄平均水平为17.65 ± 3.34 ng/ml，2月龄平均水平为34.03 ± 3.74 ng/ml，无适宜组。对126例极早产儿补充900 IU维生素D后，不同月龄间进行统计学分析示：三组间分别在1月龄、2月龄维生素D水平差异有统计学意义(P < 0.05)。母乳喂养、母乳 + 强化剂喂养、早产儿配方奶喂养比例分别为28.57%、44.44%、26.99%；维生素AD平均添加时间分别为14.40 ± 6.60 d，13.62 ± 6.88 d，12.33 ± 3.93 d，维生素D平均添加时间为10.95 ± 5.76 d，11.14 ± 6.37 d，8.44 ± 3.28 d。三组间的喂养方式、肠外喂养时间、维生素AD、维生素D添加时间无统计学意义(P > 0.05)。具体见表7、表8。
Table 7. Vitamin D levels in different months
表7. 不同月龄维生素D水平
Table 8. Feeding of very preterm infants
表8. 极早产儿喂养情况
*表示Fisher精确检验所得P值。ALP：碱性磷酸酶，Ca：钙，P：磷。
5. 讨论
在过去的几十年里，围产期医学的进步对极早产儿的预后有了极大的改善，其中胎龄 < 32周的早产儿存活率的增加最为显著 [9]。在新生儿重症监护室中，肺部的疾病是早产儿最常见的问题。RDS和BPD是早产儿的主要肺部并发症。有研究人员认为，维生素D在间充质细胞和肺泡II型上皮细胞之间的相互作用中发挥作用，并参与胎儿肺的成熟，肺泡II型上皮细胞表达维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)，参与肺的表面活性物质(pulmonary surfactant, PS)的合成和分泌等 [10]。早产儿出生后很大一部分维生素D缺乏，本研究结果显示，极早产儿刚出生时的维生素D缺乏率为92.86%，并发现维生素D缺乏导致早期肺部疾病风险增加。
5.1. 维生素D缺乏与极早产儿肺部并发症
维生素D与RDS：我们的研究显示，维生素D缺乏与RDS发生率密切相关，这与既往相关研究一致。Adham等人 [11] 对胎龄为34周的65例早产儿(40例RDS和25例无RDS)生后24 h内的血清25-(OH)D进行测定，并进行比较。结果显示：RDS组新生儿的平均血清25-(OH)D水平明显低于对照组(10.6 ng/dl vs 13.9 ng/dl, P = 0.028)。Logistic回归分析显示，生后24 h内血清25-(OH)D水平低是RDS的独立危险因素。另外，Xuefei Zhang等人 [12] 在2020年对93名极早产儿(胎龄 < 32周)研究维生素D水平与肺部疾病的关系，研究显示：三组极早产儿RDS发生率差异有统计学意义(43.6% VS 35.9% VS 20.5%, p = 0.029)，严重缺乏组RDS发生率最高。
维生素D代谢的活性形式是1,25-二羟维生素D3 (1,25-Dihydroxyvitamin D3, 1,25-(OH)2D3)，其促进肺泡II型上皮细胞合成、分化，并促进成纤维细胞的分化 [13]。VDR介导了1,25-(OH)2D3的生物活性。目前报道的已知的，有3000多个基因含有维生素D反应元件，其中大部分与肺的分化、发育有关 [14]。Ustun等人 [15] 报道VDR-TaqI-CT基因型和CC基因型与呼吸窘迫综合征的风险增加有关。Zosky [16] 等人和Mandel [17] 等人都报道了维生素D的缺乏与啮齿类动物出生时的肺发育和成熟有关。
维生素D与早期肺动脉高压：出生后肺循环血流动力学发生改变，出生后数小时内肺血流量增加10倍，肺动脉压力从全身水平下降至全身血压的50%以下 [18]。早产儿由于肺泡、肺血管等发育不成熟，各种原因导致胎儿–新生儿循环转换延迟，容易造成肺动脉高压。有关维生素D与早产儿早期肺高压的临床研究未见报道。有动物实验研究显示：孕鼠注射内毒素后，致使生后幼鼠肺血管生长受损，出生时增加了肺动脉高压的风险，而通过产前补充维生素D，可降低肺动脉高压的风险 [17]。产前内毒素可通过下调肺部VDR，干扰肺的维生素D的代谢，影响肺血管形成，致生后肺发育受损。我们的研究显示，三组之间的生后早期肺动脉高压比较无统计学意义(P > 0.05)，目前关于维生素D水平对早期肺动脉压力的影响的临床研究尚少，需要更多、更大的研究进一步论证维生素D与早期肺动脉压力之间的关系。
维生素D与BPD：早产儿肺发育包括五个阶段：胚胎期(4~7周)；假腺管期(7~17周)；小管期(17~26周)；囊形期(27~36周)和肺泡期(36周~2岁) [19]。早产儿由于肺发育不成熟，产前或生后各种不利因素引起的炎症反应导致肺损伤，肺泡发育延迟，肺间质纤维化，长期赖氧，长期依赖呼吸机，延长住院时间。BPD发病机制复杂，常常是多种因素共同介导肺损伤。动物模型研究发现，相较于维生素D充足的小鼠，宫内维生素D水平越低的小鼠，2周龄时的肺的容量越小、气道的阻力越高 [16]。另外一项测定幼鼠血清25-(OH)D水平和肺功能的研究，结果发现，孕期鼠补充维生素D不仅促进肺成熟，还能改变气道的收缩功能，从而降低新出生幼鼠的气道对乙酰胆碱的敏感性 [20]。动物实验及临床相关研究维生素D与BPD的相互关联性尚不一致。1,25-二羟维生素D [1,25-Dihydroxyvitamin D, 1,25-(OH)2D]可通过促进肺发育、降低气道敏感性及抑制炎症因子活化等多个途径降低BPD发生 [21]。在欧洲，胎龄 < 30周早产儿的BPD患病率在30%以上 [22]。Yang Yang等人 [23] 研究发现，出生胎龄 ≤ 30周的BPD与非BPD组的维生素D水平分别为：33.20 ± 16.51 vs.39.21 ± 16.65 nmol/l，差别有显著意义(P < 0.05)。另外，Cetinkaya等人 [24] 报道，通过单变量分析，土耳其出生的100名早产儿(胎龄 < 32周)队列中，较低的脐血25-(OH)D水平与BPD相关。然而，多元回归分析没有显示脐血25-(OH)D水平和BPD之间的独立相关性。KE Joung等人 [25] 研究胎龄 < 29周的44例早产儿，结果显示：维生素D水平与BPD的发生率无明显相关性(P > 0.05)。
我们的研究显示，BPD的总发生率为46.83%，出生时各组间比较显示，BPD的发生率差异有统计学的意义(P < 0.05)，发生率最高的是维生素D严重缺乏组(56.52% vs 37.50 vs 22.22%, P = 0.039)。一项对94例的极早产儿(胎龄 < 32周)研究发现，出生时25-(OH)D水平越低，其需氧量越高、应用间歇正压通气的时间越长、以及需要更高级的呼吸支持 [26]。我们的研究显示，相对于缺乏组与不足组，严重缺乏组应用无创通气时间长、机械通气比率高，住院时间长，但无统计学意义(P > 0.05)。
进一步对极早产儿生后1月龄、2月龄维生素D水平进行统计学分析显示，生后2月龄(或出院时)时维生素D严重缺乏组的BPD发生率明显增加(100% vs 53.97% vs 33.33%, P = 0.029)差异有统计学的意义(P < 0.05)。本研究是首次对生后1月龄、2月龄维生素D水平对BPD的影响进行比较。出生时维生素D水平与母孕期维生素D水平密切相关 [27]，出生时维生素D缺乏导致RDS及BPD的发生率增加，提示宫内维生素D缺乏影响宫内肺发育。同时由于极早产儿生后仍处于肺发育关键期，生后维生素D补充不足可以影响肺脏继续发育，导致肺泡肺血管发育延迟。因此对于极早产儿，出生后及时添加维生素D对促进肺发育有重要作用。
5.2. 极早产儿维生素D水平动态监测
我们的研究显示，极早产儿出生时维生素D水平为10.57 ± 4.79 ng/ml，维生素D缺乏率高达92.86%，口服补充维生素D 900 IU/d，生后1月龄时平均水平为14.89 ± ng/ml，生后2月龄时平均水平为21.13 ± 7.48 ng/ml，维生素D缺乏率仍然占53.17%。Sang等人 [28] 对体重 < 1500 g的早产儿补充维生素D研究显示，出生水平为25-(OH)D ≥ 10 ng/mL的早产儿中，在纠正36周时，早期补充800 IU维生素D可安全地实现88%的维生素D充足率(>30 ng/mL)。Grant等人 [29] 确定了800 IU/d剂量的维生素D在3个月大的婴儿中有81%达到25-(OH)D > 30 ng/mL，而400 IU/d剂量的维生素D在55%的婴儿中可维持维生素D水平不下降。而我们的研究显示，2月龄时维生素D充足率仅达14.28%，尽管补充后的维生素D缺乏明显改善，但补充900 IU维生素D仍不足以达到最佳的维生素D水平，考虑与本研究极早产儿出生时维生素D水平基础太低有关，严重缺乏率达54.76%。另外，维生素D受体基因多态性可部分解释对维生素D补充的不同反应 [28]。
在补充维生素D的过程中，早产儿需要密切监测血清Ca、P、ALP等指标。每天摄入900 IU可能导致血清25-(OH)D过多，随后升高血清Ca并增加尿Ca排泄。特别是，肾成熟延迟和矿化紊乱的早产儿易患高钙尿症和肾钙质沉着症，这是由肾脏的排泄不成熟引起的。在我们的研究中，监测的血清Ca、P、ALP结果大致都在正常范围内，也无维生素D水平过量或中毒情况。
总之，极早产儿出生时维生素D普遍缺乏，出生时及2月龄(或出院时)维生素D缺乏增加极早产儿RDS、BPD风险。目前维生素D补充剂量尚未统一，我们的研究显示针对早产儿不同的维生素D基础水平需要个体化补充。