1. 引言
2011年7月到10月在我国西南部野外调查时发现大量蚯蚓新物种 [1] - [6]，本文报道了采集自云南西双版纳自然保护区和贵州梵净山自然保护区的两个新物种。经过仔细观察，发现喜湿远盲蚓(Amynthas uvidus Sun & Jiang, sp. nov.)雄孔区呈内倾的“8”字形，受精囊孔位于5/6~8/9，盲肠单式，且纳精囊呈棒状，满盈远盲蚓(Amynthas impletus Sun & Jiang, sp. nov.)第一背孔位于10/11，雄孔上方偏内侧各有一椭圆形腺状乳突，受精囊孔位于5/6~6/7节间且每个受精囊孔下方均有一个圆形小乳突，前列腺偏小，盲管约为主体的4/5长且末端1/5膨大为卵圆形纳精囊。经查阅、对比前人相关文献 [7] [8]，将上述两物种鉴定为新物种，并将其DNA条形码提交至NCBI数据库。
两新物种均属于巨蚓科(Megascolecidae)远盲蚓属(Amynthas)。截止目前，我国已记录巨蚓科蚯蚓579种(亚种) [9]，远盲蚓属436种 [10]，为巨蚓科的优势类群，具有丰富的物种多样性 [11]。本属物种的典型特征是刚毛环生，环带大多位于XIV~XVI节，大多雄孔成对的位于XVIII节，雌孔一个，位于XIV节，受精囊孔成对的位于4/5~8/9，盲肠起于XXVII节，前列腺葡萄总状，受精囊成对 [12]。
新物种喜湿远盲蚓(Amynthas uvidus Sun & Jiang, sp. nov.)的发现地西双版纳国家级自然保护区是以保护热带森林生态系统为主要目的的大型综合性自然保护区，生物资源极其丰富，是面积最大的热带原始林区 [13]。满盈远盲蚓(Amynthas impletus Sun & Jiang, sp. nov.)的发现地梵净山国家级自然保护区主要以亚热带森林生态系统为保护对象，属于东亚季风气候区，具有典型的中亚热带季风山地湿润气候特征 [14]。以上两处湿润多雨的生境孕育了丰富的动植物新物种。
2. 材料与方法
2.1. 材料
使用挖掘手捡法采集蚯蚓标本。收集到的标本于野外制成无水乙醇浸渍标本，1周内每隔1天更换无水乙醇一次，直至标本完全脱水。采集获得蚯蚓标本2头[标本号：YN201108-01和GZ201102-02]。形态学样本浸渍于95%以上的无水乙醇中，4℃样品柜保存，用于形态学鉴定和DNA条形码提取。所有标本均保存与上海交通大学环境生态工程实验室蚯蚓标本库中。
2.2. 形态学和分子鉴定
使用体视显微镜Nikon SMZ800观察标本，参照陈义(1956)、Sims & Easton (1972)对远盲蚓属蚯蚓形态学特征的表述方式详细记录样本的外部和内部特征 [12] [15]，并绘制手绘图。收集我国和周边地区的蚯蚓物种记述文献，用于形态学鉴定。
分子鉴定使用软体动物DNA小量提取试剂盒(OMEGA E.Z.N.A.TM Mollusc DNA Kit)提取蚯蚓尾部组织DNA，获取到的DNA使用紫外分光光度计测定DNA浓度，以满足后续PCR要求，1%的琼脂糖凝胶电泳监测DNA是否提取成功，放置于−20℃冰箱备用。
选用通用引物LCO1490 (GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG)和HCO2198 (TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA)扩增线粒体CO1基因片段，PCR反应体系50 μL，体系如下：
模板DNA (按需稀释到<0.5 μg) 1 μL
引物1 (10 μM) 2 μL
引物2 (10 μM) 2 μL
Trans TaqTM DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) (TransGen Biotech) 9.6 μL
ddH2O 35.4 μL
其中Trans TaqTM DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) (TransGen Biotech)的配方为(参考产品使用说明书)：
Trans TaqTM HiFi DNA Polymerase 0.6 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
10 × TransTaqTM HiFi Buffer Ⅰ 5 μL
PCR循环条件：
PCR扩增产物2 μL使用1%琼脂糖凝胶电泳监测。PCR电泳结果产物应为单一整齐的条带，COI大小约为640 bp。
PCR产物的回收由华大基因公司完成。初步纯化采用Millipore板过膜纯化，样品经过纯化后，进行sanger法PCR扩增，之后采用EDTA法纯化。
扩增产物送交华大基因公司双向测序，测序仪器为ABI 3730XL测序仪，使用软件VECTOR NTI 9.0中的ContigExpress程序拼接双向测序结果，拼接序列最终提交至NCBI数据库以获取DNA条形码登记号。
3. 结果和讨论
3.1. 喜湿远盲蚓，新种Amynthas uvidus Sun & Jiang, sp. nov. (图1(A)~(D))
模式标本：正模标本1头成体(标签号：YN201108-01)，云南省西双版纳傣族自治州勐腊县(21˚35'03N，101˚34'58E, 772 m)，蕨类植物和灌木下，红棕色土壤，采样点属热带季风季雨林雨林气候区。蒋际宝、孙静、雷先德和冯海玮于2011年7月20日采。
词源：本新物种模式标本采集环境及其湿润，根据小生境命名为喜湿远盲蚓。
鉴别特征：该种与分布于贵州绥阳宽阔水林区和四川峨眉山的物种Amynthas contingens (Zhong & Ma, 1979)比较：雄孔区乳突特征相似，但略有差异；新种体型比A. contingens大；新种受精囊孔4对，位于5/6~8/9而A. contingens受精囊孔3对，位于6/7~8/9；新种盲肠为单式，而A. contingens盲肠为复式；新种盲管相对较长，纳精囊呈棒状，而A. contingens盲管短，纳精囊呈球状。
描述：
外部特征：体长137 mm，环带宽5.3 mm，体节数104节。背部紫色，腹部无色素，V~XIII节每节有2圈体环，背中线不清晰。口前叶1/2上叶式。背孔起于11/12。环带浅灰色，位于9/10XIII~1/10XVII节，指环状，光滑，其上无刚毛和背孔。刚毛环生，aa = 1.2ab，zz = 2zy。刚毛数：30/III，32/V，40/VIII，56/XX，52/XXV，雄孔间10 (XVIII)。雄性生殖孔1对，位于XVIII节腹侧两边，垫状凸起上，卵圆形，有2圈皮褶包围，上下各一块近圆形的腺区构成，略向内倾斜的“8”字形，雄孔间距约1/4节周长，“8”字形腺区前至XVII节刚毛环，后至XIX节刚毛环(图1(A)，mp)。雌性生殖孔1个，位于XIV节腹侧中央。受精囊孔4对，位于5/6~8/9，孔小(图1(A)，sp.p)。
内部解剖：隔膜5/6~7/8厚，肌肉质，10/11~13/14较厚，8/9、9/10缺。消化道：砂囊桶状，位于IX~X节。肠自XV节开始膨大。盲肠单式，指状，起于XXVII节，向前伸至XXIV节，腹缘光滑，背缘仅24/25和25/26隔膜通过处有缺刻(图1(B))。血管：心脏4对，位于X~XIII，4对均发达，在背部连于食道上血管。雄性器官：精巢囊2对，位于X、XI，第二对精巢囊与第一对储精囊被共同包被于一膜质囊中，且左右叶在腹侧相连通，第一对精巢囊左右叶在腹侧相分离。储精囊2对，位于XI、XII，第一对发达，第二对右叶较小，左叶发达，越过12/13，第一对在腹侧相连通，第二对在腹侧相分离。前列腺发达，位于1/3XV~1/3XXI，块状分叶构成，厚，葡萄总状，前列腺管位于XVIII，粗细均匀，“U”形(图1(C))。雌性器官：受精囊4对，位于VI~IX节，长5 mm。坛囊瘦心形，长3.4 mm，坛管粗细均匀，盲管长2.8 mm，盲管柄细长，前端1/3膨大为棒状纳精囊(图1(D))。
分布：中国(云南)。
DNA条形码：GenBank登录号KF205470 (YN201108-01，正模)。
Figure 1. Amynthas uvidus Sun & Jiang, sp. nov., holotype. (A). Ventral view, sp. p spermathecal pores, mp male pores; (B). intestinal cecum; (C). prostate gland; (D). spermathecae
图1. 喜湿远盲蚓，正模。(A). 腹面，sp.p 受精囊孔，mp 雄孔；(B). 盲肠；(C). 前列腺；(D). 受精囊
3.2. 满盈远盲蚓，新种Amynthas impletus Sun & Jiang, sp. nov. (图2(A)~(D))
模式标本：正模标本1头成体(标签号：GZ201102-02)，贵州省梵净山国家级自然保护区(27˚55'04N, 108˚41'51E, 2160 m)，乔木树种下，棕色和肉桂色土壤，采样点属中亚热带季风常绿阔叶林气候区。孙静、蒋际宝、张亮亮和雷先德于2011年10月10日采。
词源：本新物种模式标本受精囊中充满精子，极具特色，根据受精囊状态命名为满盈远盲蚓。
鉴别特征：该种与分布于四川、重庆和湖北的物种Amynthas gravis (Chen, 1946)比较，体型大小相似、刚毛式相似、受精囊孔对数和位置相同。不同点为：新种第一背孔位于10/11，而A. gravis位于12/13；新种刚毛较稀，而A. gravis刚毛密集；新种雄孔区乳突仅分布于XVIII节，而A. gravis分布于XVII~XIX节；新种第XI节的精巢囊和储精囊彼此分离，而A. gravis该节的精巢囊包被储精囊；新种的受精囊坛管比A. gravis的坛管短。
描述：
外部特征：体长79 mm，环带宽3.7 mm，体节数93节。背侧深紫色，腹侧无色素，X~XIII节每节有2个体环，背中线清晰。口前叶1/2上叶式。背孔起于10/11。环带无色素，位于XIV~XVI节，指环状，光滑，其上有背孔，XVI节腹侧有6根刚毛。刚毛环生，aa = 1.2 − 1.3ab，zz = 1.8 − 2zy。刚毛数：40/VIII，36/XX，44/XXV，雄孔间7 (XVIII)。雄性生殖孔1对，位于XVIII节腹侧两边，呈椭圆形较矮腺状凸起，雄孔上方偏内侧各有一椭圆形腺状乳突，雄孔间距略小于1/3节周长(图2(A), mp)。雌性生殖孔1个，位于XIV节腹侧中央。受精囊孔2对，位于5/6~6/7节间，孔间距略小于1/2节周长，每个受精囊孔下方偏内侧有个圆形小乳突(图2(A), sp.p)。
Figure 2. Amynthas impletus Sun & Jiang, sp. nov., holotype. (A). Ventral view, sp. p spermathecal pores, mp male pores; (B). intestinal cecum; (C). prostate gland; (D). spermathecae
图2. 满盈远盲蚓，正模。(A). 腹面，sp. p 受精囊孔，mp 雄孔；(B). 盲肠；(C). 前列腺；(D). 受精囊
内部解剖：隔膜5/6~7/8和10/11~13/14较厚，8/9、9/10缺。消化道：砂囊桶状，位于IX~X节。肠自XV节开始膨大。盲肠单式，起于XXVII节，向前伸至XXII节，指状，背腹缘均光滑(图2(B))。血管：心脏4对，位于X~XIII，后2对发达，均连于食道上血管。雄性器官：精巢囊2对，位于X、XI，卵圆形，发达，左右叶在腹侧相分离，具银白色光泽。储精囊2对，位于XI、XII，发达，左右叶在腹侧相分离。前列腺中等发达，偏小，位于1/2XVIII~XIX，由上下两大块组成，下面为两个指状分叶，前列腺管倒“U”形，位于XVIII，腹侧管比背侧管略粗(图2(C))。雌性器官：受精囊2对，位于VI~VII节，长1.8 mm。坛囊卵圆形，长约1.1 mm，坛管下细上粗，盲管约为主体的4/5长，末端1/5膨大为卵圆形(图2(D))。
分布：中国(贵州)。
DNA条形码：GenBank登录号KF179577 (GZ201102-02，正模)。
4. 结论
本文报道了采自中国云南西双版纳国家级自然保护区热带森林生态系统中的蚯蚓新物种喜湿远盲蚓Amynthas uvidus Sun & Jiang, sp. nov.和中国贵州梵净山国家级自然保护区亚热带森林生态系统中的蚯蚓新物种满盈远盲蚓Amynthas impletus Sun & Jiang, sp. nov.。文中同时提供了形态学和分子DNA条形码证据。标本保存于上海交通大学环境生态工程实验室蚯蚓标本库。
基金项目
国家自然科学基金项目(42077028和41701272)；成都工业学院博士基金项目(2019RC008)；成都工业学院环保大数据平台；中国国家科技基础资源调查项目(2018FY100300)。
NOTES
*通讯作者。