滇南杜鹃的无菌播种与快繁研究
Sterile Sowing and Rapid Propagation of Rhododendron hancockii Hemsl
DOI: 10.12677/BR.2022.112013, PDF, HTML, XML, 下载: 462  浏览: 663  科研立项经费支持
作者: 黄向群:香格里拉市住房和城乡建设局园林绿化管理局,云南 香格里拉;宋 杰:云南省农业科学院花卉研究所,云南 昆明;关文灵, 李济倩, 李叶芳:云南农业大学园林园艺学院,云南 昆明
关键词: 滇南杜鹃组织培养快繁无菌萌发种子Rhododendron hancockii Hemsl. Tissue Culture Rapid Propagation Aseptic Germination Seed
摘要: 本实验以野生滇南杜鹃种子为试验材料,通过组培的方法探究滇南杜鹃种子无菌播种与快繁技术体系。结果表明:最佳消毒方法为:70%酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (2次),然后接种于WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA培养基中,滇南杜鹃种子萌发率为76.67%、污染率16.67%。诱导不定芽的最佳培养是WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA,30 d后每株平均分化芽数为2.92,苗叶色深绿,枝条粗壮,丛生芽增多。较好的生根培养基是WPM + 1 mg/L NAA + 1 mg/L IBA,30 d统计生根率为57%,平均生根数是3.21,根长势最好,形态正常、生长整齐。研究结果为滇南杜鹃的扩大繁殖和资源保护提供了参考。
Abstract: In this experiment, the technique system of aseptic seeding and rapid propagation of wild Rhododendron hancockii Hemsl. seeds was studied by tissue culture. The results showed that the best disinfection method was: 70% alcohol soaked in 30 s + 0.1% mercury for 3 min (twice); then inoculated in the medium of WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA, the germination rate of R. hancockii Hemsl. seeds was 76.67% and the contamination rate was 16.67%. Induction of adventitious buds of the best culture was WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA. After 30 days per plant, average number of bud formation was 2.92; seedling leaf was dark green; cespitose bud increased. The best rooting medium was WPM + 1 mg/L NAA + 1 mg/L IBA, the rooting rate of 30 d was 57%, the average rooting number was 3.21, and the root grew best, and the shape was normal and the growth was regular. The results provide reference for expanding propagation and resource conservation of Rhododendron hancockii Hemsl.
文章引用:黄向群, 宋杰, 关文灵, 李济倩, 李叶芳. 滇南杜鹃的无菌播种与快繁研究[J]. 植物学研究, 2022, 11(2): 97-102. https://doi.org/10.12677/BR.2022.112013

1. 引言

杜鹃(Rhododendron spp.)是我国的十大传统名花之一,也是世界著名的木本观赏植物 [1]。滇南杜鹃(Rhododendron hancockii Hemsl.)隶属杜鹃花科(Erieaceae)杜鹃花属(Rhododendron)马银花亚属(Subgen. Azaleastrum Planch),常绿灌木或乔木 [2],其花冠白色而具有芳香,枝繁叶茂,新叶红色,具有很强的观赏性 [3]。

杜鹃花通常采取扦插繁殖的繁殖方式,但是常绿杜鹃类由于其生根困难,繁殖系数低,同时也受繁殖季节和母株材料的影响,很难进行快速大量繁殖,极大限制了常绿杜鹃的开发与利用 [4]。目前杜鹃组织培养处理的外植体有茎尖、带腋芽的幼茎、幼叶、花蕾、种子等 [5] [6] [7] [8]。通过植物组织培养技术可以实现部分种类杜鹃的快速繁殖,这对于保护与开发其种质资源具有重要意义。

杜鹃花种子量大,播种繁殖系数高,但幼苗生长缓慢,管理困难,通过无菌播种可以有效缩短杜鹃播种育苗的生长周期。用滇南杜鹃的种子进行无菌播种和快繁研究,可为滇南杜鹃的引种驯化和种质资源保护提供科学依据。

2. 材料与方法

2.1. 试验材料

采用野生的滇南杜鹃种子,种子采自云南省玉溪市易门县。

2.2. 方法

2.2.1. 种子的杀菌处理

用纱布将滇南杜鹃种子包好,进行消毒:放入70%的酒精消毒后用无菌水冲洗2~3次,用0.1%升汞浸泡后无菌水冲洗3~4遍,再次用0.1%升汞浸泡无菌水冲洗4~5遍,之后将种子接种于初代培养基WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA。每瓶接种10粒种子,接种45瓶,每处理重复3次。接种后观察并记录不同消毒处理后的萌发率、污染率和死亡率。种子消毒方式详见表1

Table 1. Different germicidal treatments of seeds

表1. 种子不同的杀菌处理

2.2.2. 继代培养基的筛选

取培养至50~55 d的滇南杜鹃无菌苗,切去顶芽和基部,留1~2 cm长的无菌苗茎段,接种于继代培养基中,每瓶接种3~4棵,接种60瓶,不定芽的诱导培养基以WPM为基本培养基,添加0.01 mg/L NAA和不同浓度的ZT (2.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mg/L),每处理重复3次。接种后观察并记录每株分化的芽数和长势。

2.2.3. 生根培养基的筛选

取30~35 d的继代培养的滇南杜鹃丛生苗,并将带顶芽的芽苗单株切下,然后每棵苗切去基部留2~3 cm,接种于生根培养基中,每瓶放4棵,接种60瓶。生根培养基以WPM为基本培养基,添加1 mg/L NAA和不同浓度的IBA (0.5、0.7、1.0 mg/L),每处理重复3次。接种后观察并记录苗的生根率和平均生根数。

2.2.4. 各指标计算公式

萌发率 = 发芽的种子数/处理种子数 × 100%

死亡率 = 未萌发种子/处理种子数 × 100%

污染率 = 污染种子数/处理种子数 × 100%

生根率 = 生根数/接种苗数 × 100%

2.2.5. 培养条件

试验所用培养基均附加7 g/L琼脂,30 g/L蔗糖,pH值控制在5.6~5.7。将培养基置于25℃条件下,12 h光/12 h暗下培养,光照强度为3000~4500 lx。

3. 结果与分析

3.1. 不同杀菌处理的效果

表2可以得出,随着消毒时间增加,滇南杜鹃污染率下降,但同时死亡率增加萌发率降低,说明在种子灭菌处理过程中,升汞长时间的浸泡容易让种子受到毒害而死亡。而短时间的消毒,如处理1又难以把种子携带的细菌消毒干净,容易产生污染。

灭菌处理后的种子接种于初代培养基中,培养40 d时,处理2和处理3的滇南杜鹃最先长出了苗,经过50 d的培养,发现处理2和处理3的滇南杜鹃总体长势很好,苗的生长速度较快,叶色浓绿、苗健壮。处理4和处理5很多苗都不生长,叶片发黄,苗矮小。综合各灭菌处理的效果,得出处理2即70%酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (两次)这个处理是最有效的消毒方法,污染率为16.67%,死亡率为23.33%,萌发率为76.67%。

Table 2. Effects of different sterilization combinations on seeds

表2. 不同灭菌组合处理对种子的影响

3.2. 不同激素配比对无菌苗继代增殖的影响

表3可以看出,继代培养的苗,在不添加激素的WPM培养基中无生长量,且未发生增殖。在处理2条件下无菌苗生长情况最明显,9 d后开始有绿色的小点突起,14 d后,切口开始有芽点冒出,30 d后之前苗上的芽点已经长成独立侧枝,40 d后苗大多数已长成丛生苗,而且处理2普遍芽大,枝条粗壮,枝条多,叶色深绿,并且分化很快也很多,长势很好。与处理2相比,其它处理下无菌苗的长势都不好:处理3和处理4叶色变淡长势变慢。处理5和处理6玻璃化问题很严重,具体表现为苗的叶和嫩枝呈水晶透明或半透明水渍状,叶片皱缩成纵向卷曲,脆弱易碎。

随着ZT的浓度增加,苗的增殖效果减弱,同时出现玻璃化现象。高浓度的ZT下的杜鹃枝条少且细小,叶色发黄,组培苗较小,苗的分化变慢,苗的总体生长趋势在下降,而低浓度的成活率高,枝条多且粗壮,叶色深绿,最好的继代培养基是处理2,即WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA。

Table 3. Effects of different hormone combinations on Subculture and proliferation of aseptic seedlings

表3. 不同激素配比对无菌苗继代增殖的影响

3.3. 不同激素配比对继代培养苗生根的影响

继代培养得到的苗放进生根培养基中培养7 d后,发现大多苗基部开始有少量的愈伤组织出现,苗的愈伤组织和基部有白色须根最先出现在IBA浓度为0.7 mg/L和1 mg/L的生根培养基中,30 d后开始统计生根率。由表4可看出,在不添加任何激素的WPM培养基中,无菌苗不能生根。在相同浓度的NAA条件下,滇南杜鹃的组培苗生根率随着IBA浓度增加而上升,当IBA浓度最高为1 mg/L时,生根率也达到最高,为57%,平均生根数为3.21。得出滇南杜鹃最佳生根培养基是:WPM + 1 mg/L NAA + IBA。

Table 4. Effects of different hormone ratios on Rooting of aseptic seedlings

表4. 不同激素配比对无菌苗生根的影响

4. 讨论

有效的控制污染是滇南杜鹃无菌播种是否成功的关键技术之一。本试验中采用了0.1%的升汞溶液为主要的消毒灭菌剂,控制其处理的次数为短时间的2次,可以一定程度上避免种子在升汞中长时间的浸泡,减少升汞对种子的毒害。本试验中:70%酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (2次)是最适宜的灭菌处理,这与吴雅文 [9] 等人对迷人杜鹃种子的灭菌试验中的结果相同。

适宜的ZT能提高苗的增殖率,组培苗芽和枝条都生长粗壮,叶片颜色为深绿,但是过高的ZT浓度下的滇南杜鹃苗较小,继代成活率低,玻璃化严重,具体表现为苗的叶和嫩枝呈水晶透明或半透明水渍状,叶片皱缩成纵向卷曲,脆弱易碎,分化能力降低,所以很难成活,严重影响了组培苗繁殖率。本实验设置了ZT的几个浓度梯度对比滇南杜鹃的增殖效果,发现与云锦杜鹃组培的结果一致 [10],即低浓度的ZT有利于杜鹃生长。另外通过试验后减少ZT浓度,发现玻璃化问题得到缓解,确定玻璃化问题主要来源于细胞分裂素的浓度过高。而且ZT费用相对较高,综合考虑可以适当减少ZT用量。

本试验发现在NAA浓度(1 mg/L)不变,而IBA浓度在0~1 mg/L的范围内时,滇南杜鹃生根率随IBA的浓度增加而增多。但是最高的生根率仅为57%,未达到较为理想的生根效果。因此后续实验中,应加大IBA浓度,以便筛选更好的滇南杜鹃生根培养基。

5. 结论

在滇南杜鹃的组织培养过程中,消毒的药剂的选择、消毒时间的把握、消毒操作都至关重要。滇南杜鹃的最适消毒方法是:酒精浸泡30 s + 0.1%升汞浸泡3 min (2次),滇南杜鹃种子在WPM + 4 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA培养基上的萌发率为76.67%。植物生长调节剂在植物组织培养过程中起到了非常重要的作用,在一定的激素比例下有助于愈伤组织的诱导,不定芽和不定根的形成。诱导不定芽的最佳培养基是WPM + 2 mg/L ZT + 0.01 mg/L NAA,每株分化的芽数是2.92。最佳生根培养基是WPM + 1 mg/L NAA + 1 mg/L IBA,生根率为57%,平均生根数为3.21。

基金项目

本项目得到云南省现代农业花卉苗木产业技术体系建设项目(2017KJTX0010)资助。

NOTES

*通讯作者。

参考文献

[1] 张长芹. 杜鹃花[M]. 北京: 中国建筑工业出版社, 2003.
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