醋酸钠对氧糖剥夺损伤后PC12的影响

Effect of Sodiun Acetate on PC12 Injury after Oxygen-Glucose Deprivation

摘要: 目的：通过OGD/R处理PC12细胞，证明NaAc在人类缺血性脑卒中中的作用和意义。方法：OGD模型的建立：用无氧糖培养液处理PC12细胞作为脑缺血再灌注损伤的体外模型；使用CCK-8比色法检测OGD损伤后NaAc对PC12细胞的保护状况；使用免疫印迹法Western blot检测OGD损伤后的NaAc对PC12中ATF-6蛋白水平的影响。结果：OGD损伤后，补充浓度为6 mM的NaAc可增加PC12的存活率(n = 6, F = 70.10, P < 0.05)；OGD损伤后，PC12中ATF-6的表达升高(t = 2.98, P < 0.05)；向正常的PC12细胞补充NaAc后ATF-6表达降低(t = 3.11, P < 0.05)；在损伤后的PC12细胞中添加浓度为6 mM的NaAc后，ATF-6的表达水平降低(n = 6, F = 2.09, P < 0.05)。结论：OGD损伤后，PC12中添加浓度为6 mM的NaAc是通过抑制ATF-6的表达来发挥神经保护作用。

Abstract: Objective: The purpose of investigating is demonstrated the effect and significance of NaAc in hu-man ischemic stroke by OGD/R treatment of PC12 cells. Methods: Establishment of OGD model: treatment of PC12 cells with Anaerobic sugar culture solution culture solution as an in vitro model of cerebral ischemia reperfusion injury; The protective status of NaAc on PC12 cells after OGD injury was detected using CCK-8 colorimetry; Effects of NaAc after OGD injury on ATF-6 protein levels in PC12 were detected using Western blotting methods. Results: After OGD injury, NaAc 6 mM sup-plementation increased PC12 survival (n = 6, F = 70.10, P < 0.05) and increased ATF-6 expression in PC12 (t = 2.98, P < 0.05). Supplementation of NaAc 6 mM to normal PC12 reduced the expression of ATF-6 (t = 3.11, P < 0.05). On the contrary, after OGD Supplementation of NaAc 6 mM to PC12 re-duced the expression of ATF-6 (n = 6, F = 20.09, P < 0.05). Conclusion: After OGD injury, intra-PC12 NaAc 6 mM supplementation exerts neuroprotective effects by inhibiting the expression of ATF-6 signaling pathway.

1. 引言

脑卒中(stroke)俗称中风，包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，是全球死亡和永久性障碍的主要原因 [1]。在缺血条件下，由于氧的中断和糖原的消耗非常显著而引起神经功能的永久性缺陷，甚至脑细胞死亡 [2]。广泛的细胞死亡和炎症反应是脑卒中病理学的两个突出方面 [3]。细胞代谢紊乱可引起内质网应激等一系列分子的变化 [4] [5]。研究发现，脑卒中后小鼠脑组织中有显著促进炎症和内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)应激的相关分子 [6] [7]。激活转录因子-6即(ATF-6)是内质网状应激的一种相关蛋白质，也是内质网状膜贯通蛋白质 [8] [9]。研究表明，药物可通过ATF-6抑制炎症和内质网状应激，显著减轻中风后脑损伤。醋酸钠又叫乙酸钠(NaAc)作为一种短链脂肪酸发挥着重要的作用。醋酸盐的化学式为C₂H₃O的一个小分子，在整个生物系统中普遍存在，参与了包含多种代谢途径的许多生化反应，已成为细胞代谢的关键替代燃料。醋酸盐生产的三个主要代谢途径，包括：1) 乙酰辅酶A途径；2) 甘氨酸合成酶依赖途径；3) 还原柠檬酸循环。由于乙酰辅酶A在原核生物和真核生物中都有表达，因此乙酰辅酶A途径被认为是生产醋酸盐的最原始的途径。正常情况下，人血清中的乙酸盐水平仅为0.2 mM左右，而在缺氧或葡萄糖缺乏状态下，乙酸盐可能成为乙酰辅酶A重要来源。补充乙酸盐可能被证明是一种新的、有效的胶质瘤治疗途径。更有文献报道含有乙酸酯的短链脂肪酸显示出降低炎症的作用 [10]。但NaAc的药物价值对脑卒中实验模型机制的研究较少。因此，本研究旨在探讨醋酸钠作为一种新的药物，能否通过氧糖剥夺(OGD)在PC12损伤后ATF-6的表达发挥神经保护作用。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

NaAc购自上海艾比化学试剂有限公司；PC12细胞购自中国科学院上海生命科学研究所；细胞培养试剂DMEM-H-Glucose、青霉素–链霉素(100×)全部从Gibico公司购买；胎牛血清是从四季青公司购买的；CCK-8购自北京Bioss生物技术有限公司；多功能酶标器购自美国Molecular Devices公司；ATF-6是Affinity抗体公司购买的；β-actin从武汉三鹰生物技术公司购买；二抗在北京索莱宝科技有限公司购买；PMSF、蛋白磷酸酶抑制剂(All-inone, 100×)从索莱宝(北京)科技有限公司购买；RIPA分解液购自上海碧云天生物技术有限公司。

2.2. PC12细胞培养

将含有PC12细胞的冻存管从液氮罐取出后立即转移到37℃水浴锅中至完全融化，吸取冻存管中的PC12细胞悬液并转移到含有5 mL完全培养基(DMEM培养基 + 体积分数0.10胎牛血清 + 体积分数0.01青链霉素混合液)的离心管中。然后用吸管吹打混匀后以1000 r/min离心5 min，弃掉上清液。再次与5 mL完全培养基混匀，接种到培养瓶中，在37℃、含体积分数0.05 CO₂的培养箱中培养。每2~3 d传代1次，传到第3代且细胞融合度达到90%时进行下一步实验。

2.3. OGD/再灌注损伤模型制备

PC12细胞培养3d后，以磷酸盐缓冲液PBS轻轻冲洗2次，Control组加入有糖细胞外液，ODG组加入无糖细胞外液。然后将OGD组细胞置于37℃厌氧箱中低氧处理1 h (气体参数设置为体积分数0.01 O₂ + 体积分数0.94N₂ + 体积分数0.05 CO₂)将Conrtol组PC12细胞置于正常培养箱中，氧处理结束后，将各组培养液换为等体积无血清培养液。

2.4. 分组及处理

为了研究NaAc对OGD损伤后PC12细胞存活率的影响，实验将培养的PC12分成Control组(正常的培养液)、OGD组(无糖无氧的培养液处理)、OGD+NaAc组(无糖无氧的培养液中加入浓度为6 mM的NaAc)；为了研究缺血再灌注损伤后PC12细胞中ATF-6蛋白量的变化，将实验分为Control组(DMSO处理组)、OGD/R 6 h组(氧糖剥夺复氧6 h)；为研究NaAc对ATF-6在正常PC12细胞中表达的影响，将实验分成Control组(正常的培养液处理)，NaAc组(6 mM浓度的NaAc)；为了研究PC12细胞中NaAc的增加对OGD损伤后ATF-6表达量的影响，将实验分为Control组(正常的培养液处理)、OGD组(无糖无氧的培养液处理)；OGD + NaAc组(无糖无氧的培养液加入6 mM浓度的NaAc)。各组蛋白含量的检测均在OGD复氧后6 h进行。

2.5. 免疫印迹法检测(Western Blotting)

各组蛋白于复氧后6小时提取，用RIPA裂解液在冰上裂解细胞，用BCA法测定相应蛋白浓度，配置浓缩胶和分离胶，每孔10 μg蛋白计算上样量，电泳后转膜至PVDF膜上，用5% (wt/vol)牛血清白蛋白或5% (wt/ol)脱脂干奶在TBST(含0.1%TBS Tween20)中封闭膜。在室温下孵育60分钟，在4℃下与ATF-6的一抗(比例为1:1000)孵育过夜，用TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10分钟，然后在室温下与HRP偶联的二抗孵育60分钟。用TBST溶液清洗PVDF膜3次，每次10分钟，用化学发光试剂检测抗原–抗体复合物。用Image J软件对蛋白条带进行半定量分析，实验重复3次取平均值。

2.6. CCK-8比色法

弃掉96孔板中的培养基，然后用PBS清洗一次细胞，每孔加入浓度为10%的CCK-8溶液(避免产生气泡)，在培养箱中避光孵育4 h；使用酶标仪检测各孔在波长450 nm处的吸光度(A)值并进一步计算细胞存活率，OGD组细胞存活率(%) = OGD组/对照组 × 100%；OGD + NaAC组细胞存活率(%) = OGD + NaAC组/OGD组 × 100%。

2.7. 统计学处理

使用Graph Pad Prism8.0软件对所得数据结果进行统计学分析。计量数据以c ± s形式表示，多组比较采用单因素方差分析 [11]，两独立样本均数的比较采用t检验，组间两项比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. NaAc对OGD损伤后PC12细胞存活的影响

OGD损伤及加入NaAc后，培养PC12细胞的存活变化见表1。各组PC12细胞中ATF-6的存活率有显著差异，(n = 6, F = 70.10, P < 0.05)与Control组相比，OGD组PC12细胞的存活率明显降低，差异具有统计学意义(t_lsd = 10.89, p < 0.05)；OGD + NaAc组的PC12细胞的存活率与Control组相比明显降低，差异具有统计学意义(t_lsd = 6.40, p < 0.05)；与OGD组相比，OGD + NaAc组PC12细胞的存活率明显升高，差异具有统计学意义，(t_lsd = 6.04, p < 0.05)。

Table 1. The effect of NaAc on the survival of PC12 cells after OGD injury (n = 6, x/%, $\bar{x}\pm s$ )

表1. NaAc对OGD损伤后PC12细胞存活的影响(n = 6, x/%, $\bar{x}\pm s$ )

注：n = 6，x/%， $\bar{x}\pm s$ ；^*代表与Control组比较，^**代表与OGD组比较，P < 0.05。

3.2. OGD损伤后PC12细胞中ATF-6水平变化

Western blot检测结果表明，AFT-6在PC12细胞中内表达，并且在OGD损伤后的PC12细胞中ATF-6的表达增加。OGD/R 6 h组与Control组相比，ATF-6蛋白表达明显上升(t = 2.98, P < 0.05)。这些数据表明ATF-6介导了OGD后细胞的损伤。见图1。

Figure 1. Western blot detection of changes in AFTF-6 protein levels within PC12 cells after OGD/R 6 h

图1. OGD/R 6 h后PC12细胞内AFTF-6蛋白水平变化的Western blot检测

3.3. 补充NaAc对正常PC12细胞中ATF-6表达的影响

在正常PC12细胞中加入NaAc 6 mM，Western blot检测结果表明，在培养相同时间的PC12细胞中，NaAc组ATF-6蛋白表达水平较Control组明显下降(t = 3.11, P < 0.05)。见图2。这些数据说明了NaAc可以使正常PC12细胞中的ATF-6表达量降低。

Figure 2. Western blot detection of the effect of NaAc on ATF-6 protein levels in normal PC12 cells

图2. NaAc对正常PC12细胞中ATF-6蛋白水平影响的Western blot检测

3.4. OGD损伤后补充NaAc对PC12细胞中ATF-6的表达的影响

在PC12细胞OGD 2 h后新培养基中加入NaAc 6 mM，于再灌注6小时后Western blot检测结果显示，各组PC12细胞中ATF-6的表达量有显著差异(n = 6, F = 20.09, P < 0.05)；在OGD 6 h后，OGD组的ATF-6蛋白表达水平升高(t_lsd = 6.33, P < 0.05)；OGD + NaAc组的ATF-6蛋白表达水平与OGD组相比明显降低(t_lsd = 2.94, P < 0.05)；与Control组相比，OGD + NaAc组的ATF-6表达明显上升，差异具有统计学意义(t_lsd = 3.39, P < 0.05)。见图3，说明了OGD损伤后ATF-6表达量升高，补充NaAc使PC12细胞内ATF-6表达量降低。

Figure 3. Western blot detection of the effect of adding NaAc on changes in ATF-6 protein levels within PC12 cells after OGD/R 6h

图3. OGD/R 6h后加入NaAc对PC12细胞内ATF-6蛋白水平变化影响的Western blot检测

4. 讨论

脑卒中是一种全球发病率高、致残率高、死亡率高的疾病，也是造成全球永久性致残和死亡的主要原因，但目前治疗水平仍面临巨大挑战 [12] [13]。缺血性脑卒中占其85%左右 [14]，形成以神经元坏死为主的核心区及缺血半暗带 [15] [16]。半暗带内出现神经元代谢紊乱，同时伴有凋亡发生。细胞代谢紊乱可引起一系列分子变化，包括内质网应激障碍 [4] [5]。同时缺血区因突发糖氧供应而中断代谢紊乱，未折叠或错误折叠的蛋白质蓄积在内质网中，诱发内质网应激 [17] 和细胞稳态失衡，从而进一步引起组织和器官损伤 [18]。缺血性中风占绝大多数，发病时给很多家庭和社会造成了沉重的负担 [19]。因此，寻找脑缺血再灌注损伤后可能的内质网应激相关靶点，对寻找减轻脑损伤的药物具有重要意义。

越来越多的证据表明内质网应激在细胞存活过程中起着重要作用 [20] [21] [22]。内质网应激信号路径包括ATF-6、IRE1-α和PERK等路径。研究表明，脊髓损伤后大鼠神经元出现内质网应激，ATF-6表达升高，miR-211-5p直接靶向作用于ATF-6，缓解神经元凋亡和炎症 [23]。也有证据表明阿尔茨海默病患者神经元样细胞内质网应激相关蛋白ATF-6表达升高，草酸可通过下调ATF-6表达发挥细胞保护作用 [24]。提示ATF-6及其下游通路对细胞命运有很大影响。醋酸钠(NaAc)由不能消化的食品残渣和肠道内源性上皮源性粘液的厌氧发酵产生，NaAc作为短链脂肪酸，含有醋酸酯的短链脂肪酸显示出降低炎症的作用 [12] 在缺氧或葡萄糖缺乏状态下，醋酸盐可能成为乙酰辅酶A的重要来源，补充醋酸盐是一种新的、有效的胶质瘤治疗途径 [25]。显而易见，乙酸盐的补充增强了小鼠的抗应激能力 [26]。并且，NaAc通过上调p53通路来抑制肿瘤细胞的生存 [27]，确认了OGD损伤后的NaAc对PC12细胞的影响。因此，补充NaAc可能成为缺血性脑卒中治疗的新靶点。

本研究采用PC12细胞培养后OGD体外模型，证明了NaAc对缺血再灌注损伤的作用机制。缺血再灌注损伤后，PC12细胞中ATF-6蛋白水平表达升高，补充NaAc抑制ATF-6表达，促进细胞存活。有文献报道，NaAc可以自由通过血脑屏障和细胞膜，增加蛋白质的乙酰化 [25]。补充NaAc还可能通过促进p53的表达发挥神经保护作用 [25] [28]。NaAc还具有抑制炎症、促进细胞自主代谢调节等多种作用 [29]。因此，NaAc可能通过抑制ATF-6的表达来抑制炎症和内质网应激，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

然而，本研究也存在一些局限性，首先，需要进一步研究与内质网应激相关分子ATF-6相关的下游效应因子或信号通路，如ATF-6/CHOP，ATF-6/AKT信号通路来验证OGD/R诱导的神经损伤。其次，将进一步开展神经元培养和建立体内模型等方法，采用多指标分析进一步证实NaAc对脑卒中的神经保护作用。综上所述，NaAc作为一种很有前途的治疗药物，在治疗脑卒中发挥着重要意义，后续将在动物模型中继续探讨。

基金项目

国家自然科学基金资助项目(8217051911)。