1. 引言
栀子(Gardenia jasminoides Ellis)又叫山栀子，在中医药领域中的应用已延续了几千年，最早记载于《神农本草经》，药性苦寒，归心、肺和三焦经，能泻肺火、去肌表之热，质地轻清上行，在外感热病、表里有热之际能起到表里双解的作用，临床上主要使用方法是炮制用和生用。其含有的黄色素、有机酸、环烯醚萜类等能很好地起到降温镇痛、降血糖、降血脂、抗炎消肿、保护神经、保肝利胆、心血管防护等作用。除环烯醚萜苷和黄色素外，还有熊果酸、β-谷甾醇和栀子花乙酸等三萜类、5,7,3',3'-二羟基-7,4',5'-三甲氧基等黄酮类、多糖，现代研究表明都具有一定的药理活性 [1] 。其中，环烯醚萜苷和黄色素通常被认为是主要的生物活性和特征成分，现在研究对栀子主要成分提取的方法主要有超声提取法、回流提取法、浸取法等 [1] [2] [3] 。
网络药理学是一门借助网络方法能将药物与疾病、靶点、通路之间的协同作用关系进行可视化的一门学科，具有整体性、系统性等优点 [4] ，巧妙地打破了传统的单一靶标研究思维，十分契合中医的整体观、辨证论治思想，为研究复杂的中药体系提供了新思路，是研究中药药效物质和作用机制的有力工具 [5] 。目前，基于网络药理学对栀子治疗某一疾病作用的探讨已有作者提出，如栀子入血成分能抗阿尔茨海默病 [6] ，作用机制的研究主要集中于栀子中环烯醚萜类成分 [7] 、栀子抗胆汁淤积 [8] 、栀子抗焦虑作用 [9] 等。栀子的多靶点、多通路特点，有治疗多种疾病的优势，由于未见文献对栀子治疗不同疾病潜能进行报道，基于此，本文对目前栀子已知的成分、靶点，通过可视化技术将生物网络中“药物–靶点–基因–疾病”间的大量信息及他们之间的相互作用的复杂联系转化为直观的可视网络，通过网络关系直观地预测或揭示药物对机体的作用机制 [10] ，以期为栀子的临床应用与开发提供参考。
2. 方法
2.1. 栀子活性成分的筛选与靶点预测
以栀子为关键词，对栀子相关靶点和已知化学成分在TCMSP数据库(https://tcmsp-e.com/)中检索并下载，将靶点的重复项删除之后即为栀子治疗疾病的潜在靶点。再通过UniProt数据库将所有靶点转化为基因简称。
2.2. 蛋白互作网络(PPI)构建与分析
将筛选出的靶点导入String (https://string-db.org/)中，设置种类为“Homo sapiens (人类)”构建靶点互作网络图(PPI)，置信度设置过低不利于可视化分析，所以设置置信度为> 0.9，隐藏网络中离散点，将结果以TSV文件进行保存，导入Cytoscape 3.9.0中，采用其“Network Analyzer”选项进行分析，根据Degree值确定的核心靶点。
2.3. GO富集分析及KEGG通路分析
将药物共有靶点导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)中，下载细胞组分(Cellular Component, CC)、生物过程(Biological Process, BP)和分子功能(Molecular Function, MF)文件进行GO富集分析，按照FDR值大小降序排列选前10条，结果以柱形图的形式进行展示。下载KEGG信号通路文件，按照FDR值大小降序排列选前10条，结果以气泡图的形式进行展示。
2.4. 栀子治疗疾病潜能预测
在CTD数据库(http://ctdbase.org/)中导入筛选的KEGG信号通路，通过“Batch Query”进行批量查询并下载每条通路相关联的疾病。将所有通路获得的疾病通过EXCEL进行同类合并统计，筛选出频次出现最多的前6个疾病。
2.5. 构建“成分–靶点–通路–疾病”网络
为明确栀子对治疗疾病的作用机制，直观地呈现栀子各成分治疗筛选出的疾病的作用途径，将栀子的成分、各成分对应的靶点、通路及通路对应的疾病导入Cytoscape 3.9.0做网络图
3. 结果
3.1. 栀子的化学成分及靶点
通过TCMSP共获得栀子化学成分包括藏花酸(crocetin)、京尼平(genipin)、京尼平苷(geniposide)、芦丁(rutin)、乌苏酸(ursolic acid)、槲皮素(quercetin)等98个，能查到靶点的化学成分共有61个，对应靶点654个，删除重复靶点后，栀子共获得的潜在靶点有CHRM3、CHRM1、ADRA1A、CHRM2等248个。
3.2. 蛋白互作网络构建及核心靶点筛选结果
将248个靶点导入String数据库，构建栀子的蛋白互作网络，如图1，该网络中共有number of nodes：248个，number of edges：976个，average node degree：7.87，avg. local clustering coefficient：0.391，expected number of edges：344个。用Cytoscape 3.9.0软件筛选出Degree值靠前的前10个节点作为栀子的核心靶点，进行可视化处理，如图2。包括TNF、TP53、AKT1、MAPK1、RELA、STAT3、JUN、MAPK8、FOS、MAPK14。
Figure 1. Network diagram of protein interaction
图1. 蛋白互作网络图
Figure 2. Network diagram of core targets of Gardenia jasminoides Ellis
图2. 栀子核心靶点网络图
3.3. GO富集分析结果
将栀子的靶点248个导入DAVID数据库进行GO富集分析，共得到CC (Cellular Component)共101个、MF (Molecular Function)共178个、BP (Biological Process)共874个，以FDR值进行筛选，分别对排名前10的GO注释条目进行可视化处理，结果如图3。结果显示，生物过程包括response to hydrogen peroxide、circadian rhythm、adenylate cyclase-activating adrenergic receptor signaling pathway、negative regulation of apoptotic signaling pathway、positive regulation of endothelial cell proliferation等；细胞组分主要有RNA polymerase II transcription factor complex、receptor complex、glutamatergic synapse、nucleoplasm、chromatin等；分子功能包括peptidase activity、cytokine activity、binding, bridging、protein domain specific binding等，这表明栀子发挥治疗作用可能主要是通过调节这些生物过程，作用机制涉及多个途径。
Figure 3. GO enrichment analysis diagram of action targets of Gardenia jasminoides Ellis
图3. 栀子作用靶点GO富集分析图
3.4. KEGG通路分析结果
栀子的248个靶点经过KEGG通路富集分析，将物种定义为“人类”，共得到信号通路188条，以FDR值从大到小顺序排名后，通过筛选栀子KEGG富集结果显著性较强的前10条信号通路进行展示，结果如图4。其中，排名较前的有Chagas disease、Chagas disease、Growth hormone synthesis, secretion and action、cAMP signaling pathway、Salivary secretion和Pancreatic cancer、Diabetic cardiomyopathy、Natural killer cell mediated cytotoxicity、Hepatitis C、Prolactin signaling pathway等。这表明栀子治疗疾病可能是通过调控这些通路。
3.5. 栀子治疗潜能预测
以FDR进行降序排序，选取KEGG前10条通路用CTD数据库进行疾病分析，得到出现频次前6的疾病，分别为癌瘤、前列腺肿瘤、腺癌、乳腺肿瘤、肝硬化、胃癌，见表1。
Figure 4. Bubble diagram of KEGG enrichment results
图4. KEGG富集结果气泡图
Table 1. Potential targets of Gardenia jasminoides Ellis in the treatment of diseases
表1. 栀子治疗疾病的潜在靶点
注：交集靶点是指栀子成分作用靶点与疾病靶点的共有靶点。
3.6. “成分–靶点–通路–疾病”网络构建
用Cytoscape 3.9.0软件建立栀子“成分–靶点–通路–疾病”交互网络，见图5，清楚地展现栀子的活性成分、通路、靶点与不同疾病的作用关系，也揭示栀子的药效作用机制。
注：橙色代表栀子，绿色代表栀子成分，粉红色代表蛋白靶点，蓝色形代表通路，黄色代表疾病。
Figure 5. The “component-target-pathway-disease” interactive network of Gardenia jasminoides Ellis
图5. 栀子的“成分–靶点–通路–疾病”交互网络
4. 讨论
中药的一个成分对应多个靶点与多个通路，一个靶点又对应多个成分与多个通路，通过网络药理学更能直观地展示中药“多途径、多层次、多靶点”的特点 [11] 。栀子具有治疗利尿、利胆、消炎和解热等作用 [12] ，其中活性成分之一栀子苷元，在抗肿瘤、治疗肝硬化等方面，近年来研究发现都疗效显著，发现其作为一种新兴药物中间体的诸多药用价值，有很好的应用前景 [13] 。为进一步探究栀子的作用机制及治疗潜能，本文通过网络药理学的方法筛选出栀子的核心靶点和相应的信号通路进行分析。研究发现，栀子可以用作多种疾病的治疗，其中通过KEGG代谢通路分析发现治疗排名前6的疾病分别是癌瘤、前列腺肿瘤、腺癌、乳腺肿瘤、肝硬化、胃癌。接下来将对治疗这几种疾病所发挥的作用机制进行分析。
祖国医学对于癌瘤，远在两千年前已有记载，《中国医学百科全书》中指出，恶性肿瘤又称癌瘤 [14] ，一般把来源于上皮组织的恶性肿瘤称为癌瘤，典型的有乳癌、肺癌等 [15] ，是由正常细胞转向癌细胞，而癌细胞具有无限增殖、易转移的特点 [16] 。现代研究表明，栀子萜类化合物京尼平能够阻碍前列腺细胞内的解偶联蛋白2号基因的表达，抑制癌细胞的生长、增值，并诱导癌细胞的快速凋亡，打乱癌细胞病变周期的进程来实现治疗肿瘤 [17] 。藏红花素和藏红花酸成分能下调促炎症因子表达、诱导细胞凋亡，对白血病、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤具有一定的抑癌和抗癌能力 [18] ，栀子多糖口服对小鼠肝癌实体瘤的抑制率达49% [19] 。前列腺肿瘤是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤 [20] ，栀子里面的槲皮素，是本研究筛选出的主要活性成分之一，能通过调节IGF-1信号通路抑制大鼠前列腺肿瘤细胞的增殖，还可以刺激IG-FBP-3的升升高，随着前凋亡蛋白的增加和细胞凋亡升高了游离状态的IGF-1，阻止了细胞过度分裂增殖 [21] ，还能促进前列腺肿瘤细胞中微管的分解、对人体结肠直肠肿瘤细胞有抗增值的能力、抑制人体结肠肿瘤细胞系和最初的结肠直肠肿瘤中P21-RAS的表达、抑制LNCaP前列腺细胞中雄激素受体的表达和功能 [22] 。还能与其他药联用，如槲皮素与他莫西芬联合预处理CWR22前列腺肿瘤细胞，显著降低了细胞vEGF121，vEGF165的表达 [23] 。槲皮素可通过非ER的机制发挥抗乳腺肿瘤的作用 [24] ，栀子苷元可以上调AGS，MKN-45和MKN-28细胞中p53、LC3的蛋白表达，引发凋亡细胞死亡和自噬，联合奥沙利铂组引发的胃癌凋亡和自噬效果更佳 [25] 。栀子主要成分西红花苷-1、栀子苷无明显抗胃癌药理活性，而西红花酸则具有显著抗胃癌药效，可能是西红花苷-1代谢为西红花酸发挥抗胃癌药效 [26] 。随着中医药的现代化发展，中医药在恶性肿瘤治疗中应用越来越广泛。为了充分利用栀子，我们既要有深度的研究去探索栀子的治疗机制，又要结合网络药理学等现代科学技术推动中医药治疗恶性肿瘤的精准化，才能进一步阐明中医药治疗疾病的分子相关机制，使中医药在抗癌方面更充分地发挥作用。
肝硬化指由一种或多种病因长期、反复刺激肝脏而造成的肝弥漫性损伤，属于中医学“臌胀”、“积证”的范畴，隶属中医古代四大疑难症(风、痨、鼓、膈)之一 [27] ，主要是由邪毒侵袭、情志郁结、饮酒内伤等引起，导致肝脾功能失调、气虚血滞、络脉不通 [28] 。栀子与各种药材配伍用于治疗肝硬化临床应用不计其数，茵陈蒿汤及其类方是治疗肝硬化湿热内蕴的常用方剂 [29] 。有研究者选用茵陈蒿汤、栀子柏皮汤、茵陈五苓散、甘露消毒丹和茵陈四逆汤治疗肝硬化湿热内蕴证，结果显示茵陈蒿汤疗效最佳，而栀子柏皮汤、茵陈五苓散和甘露消毒丹也能改善个别指标 [30] 。其中，栀子的活性成分栀子苷用于治疗肝硬化，研究表明是因为京尼平能够抑制肝脏星状细胞的活性而达到对肝硬化疾病的治疗 [31] 。芦丁也可以延缓脂肪肝、肝纤维化及肝硬化的进程 [32] 。许壮强等研究发现，槲皮素可能通过抑制TLR4/CXCL9/PREX-2通路减轻肝硬化大鼠炎症反应，缓解肝硬化进程，保护肝功能 [33] 。文献检索发现，栀子治疗肝硬化的研究近年来较少，但资源调查发现苗族 [34] 、侗族 [35] 在临床上使用栀子治疗肝硬化都得到了很好的效果，且通过网络药理学也预测了栀子对治疗肝硬化有很好的潜能，以期为栀子治疗肝硬化的研究提供基础。
5. 结论
综上所述，本文通过网络药理学分析，初步对栀子的作用机制与治疗潜能进行了探索，发现栀子对多种疾病具有一定的治疗意义。其中，栀子可以通过cAMP信号传导途径、催乳素信号通路等信号通路对癌瘤、前列腺肿瘤、腺癌、乳腺肿瘤、肝硬化、胃癌等疾病发挥治疗潜能。且通过网络药理学的预测结果与栀子的现有药效研究的吻合度较高，对栀子的现有研究与临床应用进行了佐证，为后续开发栀子治疗前列腺癌、肝硬化等疾病提供了研究基础。
基金项目
贵州省科技基金项目(黔科合基础[2020] 1Y391)；贵州省科技创新人才团队(黔科合平台人才[2020] 5010)；贵州省发改委工程研究中心建设项目(黔发改高技[2020] 896号)；贵州省科技支撑计划项目(黔科合支撑[2021]一般131)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。