1. 引言
III型前列腺炎即慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome, CP/CPPS)，属成年男性中最常见的一种前列腺炎 [1] ，是以持续性盆腔区域疼痛不适、排尿异常、性功能障碍为主要临床表现的泌尿男科疾病。其症状反复，难以治愈，长期可导致患者出现精神心理疾病 [2] ，且对患者生活质量造成了严重影响 [3] 。据统计，我国CP/CPPS的发病率为6.0%~32.9% [4] 。现代医学主要使用抗生素和(或)α受体阻滞剂等药物对症治疗 [5] ，然而，使用α受体阻滞剂治疗的同时会给患者带来鼻塞、体位性低血压、逆行射精等难以避免的副作用 [6] [7] ，其次，此类药物难以改善CP/CPPS引起的勃起功能障碍、早泄、精神心理异常等症状 [8] 。随着对CP/CPPS发病机制的深入研究以及中医事业的长久发展，从中医药宝库中探索高效、低毒的药物具有重要意义。
CP/CPPS属于中医“精浊”范畴，中医认为本病与肝、脾、肾、膀胱密切相关，其病机多为肾虚、肝郁、湿热、瘀滞 [9] 。研究发现，III型前列腺炎患者的中医证型主要以气滞血瘀证为主 [10] 。复元活血汤出自元代李东垣《医学发明》，方中柴胡疏肝行气，气行则血行，为君药，当归补血、活血、止痛，甘草缓急止痛，为臣药；穿山甲、瓜蒌、桃仁、红花破血祛瘀通络，为佐药，大黄荡涤败血为使药，诸药合用可活血祛瘀，疏肝通络，因穿山甲药物稀少，且为濒危动物，故多删减此味药物或使用其他药物替代。临床研究发现复元活血汤治疗CP/CPPS疗效确切 [11] [12] [13] ，可明显改善患者的疼痛、排尿症状，提高患者的生活质量，但复元活血汤药物成分丰富，靶点多样，对于治疗CP/CPPS的作用机制尚未阐明。故本文借助网络药理学方法，分析复元活血汤治疗CP/CPPS的主要活性成分、关键靶点、通路，探讨其治疗的可能作用机制，以期为下一步临床研究提供参考。
2. 资料与方法
2.1. 复元活血汤的活性成分及药物靶点筛选
运用中药系统药理学分析平台(TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)，分别检索柴胡、当归、甘草、瓜蒌、桃仁、红花、大黄的活性成分，并以生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18为过滤条件，获取复元活血汤的活性成分。再次使用TCMSP数据库获取活性成分对应的作用靶点。利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)检索药物作用靶点获取其基因名称并去除重复基因。
2.2. 检索CP/CPPS的疾病靶点
以“Chronic Prostatitis、chronic pelvic pain syndrome”为关键词，分别在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/search)、OMIM数据库(https://omim.org/)及Drugbank数据库(https://go.drugbank.com/)中检索CP/CPPS的疾病靶点，其中对GeneCards数据库中检索出的数据，以相关度分值(Relevance score)的中位数为过滤条件，剔除其小于中位数的疾病靶点，以获得与疾病更加相关的靶点。将四个数据所获取的CP/CPPS的疾病靶点进行合并及去除重复靶点，并利用R软件的Vene程序包将复元活血汤的药物靶点与CP/CPPS的疾病靶点相映射，以获取药物与疾病的交集靶点，并绘维恩图。
2.3. 构建“中药–活性成分–靶点”网络
将复元活血汤组成药物的活性成分与潜在靶点导入Cytoscape3.9.1软件，构建中药–活性成分–靶点网络，并利用CytoNCA进行拓扑分析。
2.4. 构建蛋白互作用网络(Protein-Protein Interaction, PPI)与关键靶点筛选
将复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点导入STRING (https://cn.string-db.org/)数据库中，“Organisms”选择为“Homo sapiens”，置信度(medium confidence)设置为0.95，隐藏网络中游离的节点，将PPI分析结果导出为TSV文件，导入Cytoscape3.9.1软件，构建PPI网，并通过CytoNCA插件对网络进行拓扑分析获取网络的介数中心性(Betweeness centrality, BC)、接近中心性(Closeness centrality, CC)、度中心性(Degree Centrality, DC)、特征向量中心性(Eigenvector centrality, EC)、局部平均连通性Local Average connectivity, LAC)、网络中心性(Network centrality, NC)的数值，并以6种数值的中位数为筛选条件，分别进行两次筛选获取复元活血汤治疗CP/CPPS的关键靶点。
2.5. GO功能和KEGG通路富集分析
使用R语言的“org.Hs.eg.db”程序包把复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点转换为“entrezID”，并通过“clusterProfiler”、“DOSE”、“BiocManager”程序包进行GO功能、KEGG通路富集分析，根据富集结果，运用enrichplot、ggplot2程序包进行可视化分析。
3. 结果
3.1. 复元活血汤的活性成分及药物靶点
通过TCMSP数据库检索得到复元活血汤的活性成分183种，其中柴胡17种、当归2种、甘草92种、瓜蒌11种、桃仁23种、红花22种、大黄16种。经过Uniprot数据库查询基因名称及去重后的其对应的药物靶点242个。
3.2. CP/CPPS的疾病靶点
通过GeneCards数据库、DisGeNET数据库、OMIM数据库、Drugbank数据库查询、筛选，去重后得到CP/CPPS的疾病靶点1556个，将其导入R语言Vene程序包与药物靶点相映射后得到123个靶点，即复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点，见图1。
Figure 1. Venn diagram of Fuyuan Huoxue Tang-CP/CPPS intersection target
图1. 复元活血汤-CP/CPPS交集靶点韦恩图
Figure 2. Chinese medicine-active ingredient-target network diagram
图2. 中药–活性成分–靶点网络图
3.3. 中药–活性成分–靶点网络图
将复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点与药物活性成分数据导入Cytoscape3.9.1软件中绘制中药–活性成分–靶点网络图，见图2。该网络有267个节点及1223条边，平均度值(Degree)为9.16，图中方形节点为复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点，菱形节点为中药，三角形节点为中药共有成分，红色为柴胡的中药成分，蓝色为大黄的中药成分，绿色为当归的中药成分，粉色为甘草的中药成分，黄色为瓜蒌的中药成分，橙色为红花的中药成分，紫色为桃仁的中药成分。图中方形节点的大小与靶点Degree值相关，Degree值越大，方形节点面积越大，表示与靶点连接的药物成分越多。通过CytoNCA对此网络的中药活性成分进行拓扑分析，并根据Degree的数值进行排序，得到排名前10的活性成分，见表1。
Table 1. Main active components of Fuyuan Huoxue Tang in treating CP/CPPS
表1. 复元活血汤治疗CP/CPPS的主要活性成分
3.4. PPI网络与关键靶点
将123个复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点导入string数据库(https://cn.string-db.org/)，获得PPI分析结果，并通过Cytoscape3.9.1构建PPI网络，见图3。该网络中有103个节点和394条边，平均Degree值为7.65，图中靶点节点越大表示与其他靶点的作用关系越多。使用CytoNCA对PPI网络进行分析，以网络的BC、CC、DC、EC、LAC、NC的中位值为过滤条件，分别进行两次筛选，最终得到复元活血汤治疗CP/CPPS的关键靶点12个：苏氨酸蛋白激酶1 (AKT1)、钙黏蛋白相关蛋白(CTNNB1)、雌激素受体 1 (ESR1)、c-Fos癌基因蛋白质(FOS)、缺氧诱导因子1-α (HIF1A)、HSP90热休克蛋白-α (HSP90AA1)、丝裂原活化蛋白激酶14 (MAPK14)、丝裂原活化蛋白激酶3 (MAPK3)、Myc癌基因蛋白(MYC)、转录因子p65 (RELA)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)、肿瘤抑制因子(TP53)，见图4。
3.5. GO功能和KEGG通路富集分析
利用R语言进行GO富集分析，以P < 0.01，为筛选条件，得到1757个生物过程(biological process, BP)，154个细胞组分(cellular component, CC)，98个分子功能(molecular function, MF)，根据P值大小排序，选取排名前10的BP、CC、MF进行绘制气泡图，见图5。GO富集分析结果显示，BP主要涉及对氧化应激的反应、炎症反应的调节、对肿瘤坏死因子的反应等；CC主要有膜筏、囊泡腔、质膜蛋白复合体等；MF主要包括细胞因子受体结合、细胞因子活性、氧化还原酶活性等。
Figure 3. PPI network diagram of potential targets of Fuyuan Huoxue Tang in the treatment of CP/CPPS
图3. 复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点PPI网络图
Figure 4. Key targets of Fuyuan Huoxue Tang in the treatment of CP/CPPS
图4. 复元活血汤治疗CP/CPPS的关键靶点
通过KEGG通路富集分析，以P < 0.01，为过滤条件，共得到192条信号通路。根据P的数值进行排序，选取前20条信号通路绘制气泡图，见图6。主要有白介素-17 (IL-17)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、Toll样受体信号通路、前列腺癌、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、核因子κ B (NF-κ B) 信号通路等。
4. 讨论
III型前列腺炎的致病机制至今未阐明，病因复杂。大多数医家认为其病因与炎症反应、盆腔肌肉痉挛、氧化应激反应、免疫反应、精神心理因素等相关，可能是病原体感染、异常盆地神经肌肉活动、免疫、精神心理和内分泌激素异常等致病因素共同作用的结果 [14] 。中医认为本病是由肾气亏虚，或湿热汇聚下焦，或气血瘀滞，导致前列腺气机不畅，气血凝滞不行，瘀血阻络所致。复元活血汤为治疗活血化瘀剂的代表方，且可疏肝行气，临床研究发现，复元活血汤能抑制炎症因子的表达、缓解疼痛 [15] [16] ，改善CP/CPPS患者的排尿症状 [11] [12] [13] ，但其具体机制不明。
本文借助网络药理学方法检测到复元活血汤的活性成分183种，构建中药–活性成分–靶点网络图分析得到Degree值排名前10的成分有槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、甘草查尔酮A (licochalcone a)、黄芩素(baicalein)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、7-甲氧基-2-甲基异黄酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)、β-胡萝卜素(beta-carotene)、异鼠李素(isorhamnetin)。这些成
Figure 5. GO functional enrichment analysis of potential targets of Fuyuan Huoxue Tang in the treatment of CP/CPPS
图5. 复元活血汤治疗CP/CPPS的潜在靶点GO功能富集分析
Figure 6. KEGG pathway enrichment analysis of Fuyuan Huoxue Tang in the treatment of CP/CPPS
图6. 复元活血汤治疗CP/CPPS的KEGG通路富集分析
分可能是复元活血汤治疗CP/CPPS的主要成分，上述成分中多数为黄酮类化合物，具有抗炎、镇痛、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等多种生物活性 [17] 。其中槲皮素可以明显下调多种炎症因子的表达，而提高CP/CPPS大鼠的痛阈 [18] ，且能通过下调白细胞介素-1 (IL-1)、白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子α (TNFα)等促炎细胞因子的表达，抑制NF-κB和MAPK信号通路的磷酸化，减轻CP/CPPS大鼠前列腺组织的病理变化 [19] 。木犀草素具有较好的抗氧化作用，可通过清除自由基、恢复超氧化物歧化酶(SOD)的活性 [20] 和激活抗氧化核因子–红系2相关因子2 (Nrf2) [21] 等多途径发挥抗氧化应激作用。
PPI网络结果显示丝裂原活化蛋白激酶14 (MAPK14)、转录因子p65 (RELA)、信号转导和转录激活因子3 (STAT3)等可能是复元活血汤治疗CP/CPPS的关键靶点。MAPK14是p38MAPK中的一种，在细胞外刺激，如促炎细胞因子、神经递质、激素、物理应激等导致转录因子直接激活引起的级联反应中起重要作用，与炎症性疾病，心血管疾病和癌症的发生发展密切相关 [22] 。有研究报道槲皮素可通过抑制p38MAPK信号通路，下调CP/CPPS大鼠前列腺组织中TNF-α、IL-8表达水平，影响大鼠CP/CPPS的病情进展 [23] 。RELA即NF-κB，是一种多效性转录因子，参与了炎症，免疫，分化，细胞生长，肿瘤发生和凋亡等生物过程。一项随机实验中，发现CP/CPPS患者的血清中NF-κB含量显著高于常人，认为其在CP/CPPS的疾病过程中发挥重要的作用 [24] 。通过抑制CP/CPPS大鼠前列腺组织内的NF-κB的表达，可显著减轻大鼠前列腺组织的病理变化 [25] [26] 。STAT3是白介素-6 (IL-6)的活化因子，可以抑制吞噬细胞中Toll样受体介导的信号转导和NF-κB的转录抑制因子表达，具有抗炎机制作用 [27] 。
KEGG通路富集分析结果显示，复元活血汤治疗CP/CPPS的主要通路涉及TNF信号通路、NF-κ B信号通路、Toll样受体信号通路、MAPK信号通路等信号通路。这些通路参与了机体的炎症调节，氧化应激、细胞凋亡等。TNF由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，具有抑制肿瘤细胞、调节免疫、介导炎症等作用，其中TNF-α可激活MAPK、NF-κB及Toll样受体信号通路，能够控制机体炎症反应、细胞凋亡及下调机体的痛觉感受 [28] [29] ，表明复元活血汤通过以上通路抑制炎症的发生及影响痛觉感受来治疗CP/CPPS。
综上所述，复元活血汤可能是通过槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素等多种成分，影响MAPK14、RELA、STAT3等关键靶点，通过TNF、NF-κ B、Toll样受体和MAPK等信号通路，调节机体的炎症反应、氧化应激及痛阈治疗CP/CPPS。本文仅通过网络药理学初步分析了复元活血汤治疗CP/CPPS的机制，后期将通过动物实验进行验证，以期为治疗中医药治疗CP/CPPS提供理论依据。
参考文献