1. 引言
凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)于1988年被引进中国以来，几乎取代了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)获得巨大的经济效益。然而随着养殖规模和养殖密度的不断扩大，加之生态环境的不断恶化，凡纳滨对虾的病害问题日益突出。2017年山东省虾蟹养殖产业现状调查研究显示，对虾病害发生情况趋势逐年加重，对虾白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、弧菌等常见疫病并未从根本上解决，对虾肝肠胞虫病、虾虹彩病毒病等新发疫病也在该省对虾养殖区出现，并造成极大经济损失 [1] ；2019年天津地区土池淡水对虾养殖现状分析报告也显示，抽样调查的10个亏损池塘中，80%是由对虾偷死野田村病和急性肝胰腺坏死症导致 [2] ；2019年江苏地区凡纳滨对虾养殖病害主要包括虾肝肠胞虫、急性肝胰腺坏死症等 [3] ；2021年河北省对虾病害分析报告指出虾肝肠胞虫阳性检出率最高，提示未来可能造成较大经济损失 [4] 。
由此可见，病害问题已成为制约我国凡纳滨对虾产业增产增效的主要原因。苗种和亲本的大规模跨国际、跨区域移动现象在我国凡纳滨对虾养殖中十分普遍，导致对虾疫病被伴随传入我国并扩散 [5] ，给养殖户造成巨大经济损失，已呈现出由南方向北方扩展的流行趋势。因此，需高度重视对虾新发疫病的暴发，加大新发疫病的监测力度，已成为我国对虾养殖可持续发展的迫切要求。
2022年12月，天津市滨海新区几个相邻的凡纳滨对虾工厂化养殖车间相继发生对虾缓慢死亡，体长不均一，部分对虾尾部肌肉白浊等现象。本研究以其中2个工厂化车间症状典型的凡纳滨对虾为研究对象，开展病原学鉴定，旨在初步探索潜在的发病致病原，为我国北方地区凡纳滨对虾的病害防控提供借鉴。
2. 材料与方法
2.1. 材料
2.1.1. 试验动物
试验用患病凡纳滨对虾采自天津市滨海新区某养殖场的2个工厂化车间，平均体长为(4.0 ± 1.3) cm，病虾活体充氧打包后立即运送本实验室，在无菌条件下按照样品检测要求处理。
2.1.2. 试剂及仪器
主要试剂：CTAB购自北京索莱宝；Premix Ex Taq、无酶水等购自TaKara；营养琼脂、营养肉汤等购自北京陆桥；引物由英俊公司合成纯化；测序工作由上海生工完成。
主要仪器：高速冷冻离心机(艾本德)；PCR仪(ABI)；微量移液器(艾本德)；电泳仪(北京六一)；凝胶成像系统(伯乐)。
2.2. 方法
2.2.1. 患病对虾流行病学调查及临床症状观察
2022年12月，天津市滨海新区几个相邻的工厂化养殖场养殖的凡纳滨对虾出现了摄食量降低、活力差、尾部肌肉白浊、体长规格不均一、缓慢死亡等症状。经调查，该养殖场及周边养殖场此前未发生此类病症，所购苗种源于外省市某苗种场。养殖时间约30天，养殖水温约26℃，放养密度约1万尾/m2，发病持续时间约14天，累计死亡率约30%，且抗生素、益生菌等药物和免疫增强剂的使用效果欠佳。现场采集具有典型症状的对虾置于车载低温冰箱，并带回实验室进行采样分析。
2.2.2. 细菌及寄生虫检查
挑取具有典型症状的患病对虾，无菌条件下分别将患病对虾鳃丝、肌肉、肝胰腺、心脏以及淋巴器官等接种于营养琼脂平板，28℃培养48 h，观察细菌生长情况，挑取优势菌纯化3次，置于装有20%甘油的营养肉汤培养基中，−80℃保存备用。采用SN/T 2503-2010《淡水鱼中寄生虫检疫技术规范》 [6] 中水浸片显微镜检测方法进行病虾肝胰腺、鳃丝、心脏、肌肉、附肢等部位寄生虫的检测。
2.2.3. 菌株16S rDNA的鉴定
采用水煮法提取保存菌株的DNA [7] ，并使用16S rDNA通用引物对分离出的菌株DNA进行PCR扩增，上游引物序列为27F：5’AGAGTTTGATCCTGG 3’，下游引物序列为1492R： 5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’。扩增的PCR产物送上海生工测序，测序结果通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)网站进行在线比对。
2.2.4. 病毒检测
将患病对虾的鳃丝、肝胰腺、肌肉等组织进行解剖混合后，打碎研磨成组织匀浆液，采用2%CTAB法 [8] 提取组织匀浆液的核酸。根据GB/T 28630.2-2012 [9] 、GB/T 25878-2010 [10] 、SC/T 7232-2020 [11] 、SC/T 7237-2020 [12] 、SC/T 7233-2020 [13] 、SN/T 3492-2013 [14] 、SN/T 1151.1-2011 [15] 中相关病原PCR检测方法分别进行对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)、对虾传染性皮下及造血器官坏死病病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、对虾虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus, SHIV)、对虾急性肝胰腺坏死症(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)、对虾传染性肌肉坏死病病毒(Infectious myonecrosis virus, IMNV)以及桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)的检测。若PCR结果为阳性，则将扩增产物送往上海生工测序，测序结果通过NCBI网站进行在线比对。
2.2.5. 相关阳性病原基因序列的系统进化分析
将测序反馈测序结果通过NCBI数据库中的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列同源性分析，并从中分别下载相关基因序列，通过Clustal x软件进行多重比对，采用MEGA 7软件中邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统发育树(Bootstrap设置为1000次重复)，以确定。
3. 结果与分析
3.1. 患病虾的临床症状
采集的患病虾体长规格不均一，活力差，部分对虾体色发白，附肢、游泳足、尾扇变红，尾部、腹部肌肉组织坏死，呈白浊状(见图1)。
Figure 1. Clinical symptoms of diseased Litopenaeus vannamei cultured in the temporary pond (The arrow indicates the white and turbid part of the muscle)
图1. 养殖场采集患病凡纳滨对虾临床症状(箭头：肌肉白浊部位)
3.2. 细菌及寄生虫检测
病虾鳃丝、肝胰腺、肌肉、心脏及淋巴器官接种于营养琼脂平板28℃培养48 h后，有少量细菌生长，无优势菌株。经纯化后，挑取其中3个单菌落进行16SrDNA PCR扩增，扩增产物经测序和BLAST比对分析，结果显示，3株分离菌均为乳酸菌属(Lactobacillus sp.)。
经制片和显微观察，患病对虾肝胰腺、鳃丝、心脏和肌肉组织均未观察到寄生虫。
3.3. 病毒检测
琼脂糖凝胶电泳结果显示，所检测的7种对虾病原菌中，EHP和IMNV 2种病原扩增产物的电泳条带与阳性对照条带大小一致，片段大小分别为514 bp和328 bp，其它5种病原均未扩增出目标条带，判定为阴性。患病对虾样品EHP PCR扩增产物测序反馈序列经BLAST比对结果显示，与NCBI数据库中EHP孢壁蛋白1基因(GenBank No.: MG015710)序列相似性最高(100%)；患病对虾样IMNV PCR扩增产物测序反馈序列(GenBank No.: OQ438431)经BLAST比对结果显示，与NCBI数据库中凡纳滨对虾IMNV印度尼西亚株全基因组(GenBank No.: KJ636782)序列相似性最高(100%)，确认该患病虾为EHP和IMNV核酸阳性。
3.4. EHP与IMNV扩增片段基因序列的系统进化分析
EHP系统进化树分析结果显示(图2(A))，扩增得到的EHP孢壁蛋白1基因序列与EHP马来西亚分离株(GenBank No.: MW000459)、EHP印度尼西亚分离株(GenBank No.: KY593133)、EHP泰国分离株(GenBank No.: MG015710)、EHP印度分离株(GenBank No.: MH365434)聚为一支，与中国分离株(GenBank No.: MW269619)聚为一大类，与孢子虫属(GenBank No.: OQ023043)形成不同分支；IMNV系统进化树分析结果显示(图2(B))，扩增得到的IMNV基因序列与印度尼西亚分离株(GenBank No.: KJ636787)、印度分离株(GenBank No.: KY608806)、巴西分离株(GenBank No.: MZ593846)等聚为一大支，与所属的整体病毒科(Totiviridae)其它病毒种序列形成不同分支。
Figure 2. Phylogenetic tree constructed on the basis of gene sequences of EHP and IMNV amplified
图2. EHP和IMNV扩增序列的系统发育树
4. 讨论
本研究中的患病凡纳滨对虾主要症状表现为体长不均一，尾部、腹部肌肉出现白浊以及缓慢死亡。通过水浸片观察，未观察到寄生虫；经过重要组织器官细菌分离鉴定，只有少量细菌生长，无优势菌，经16S rDNA鉴定为乳酸菌属(Lactobacillus sp.)，推测此乳酸菌属为养殖户日常投喂的益生菌。经多种对虾常见病原PCR检测，在病虾肌肉和肝胰腺组织中扩增出符合IMNV和EHP基因大小的片段，测序比对后确认患病虾为IMNV和EHP核酸阳性，而患病对虾尾部、腹部肌肉白浊，体长不均一等表征明显，临床症状典型。综上推测，本研究所述天津地区工厂化养殖车间凡纳滨对虾发病的原因可能是由IMNV和EHP两种病原混合感染所致，但仍需进一步研究证实。
近年养殖的凡纳滨对虾中EHP的感染较普遍，EHP最早于2004年在泰国患生长缓慢综合征(Monodon slow growth syndrome, MSGS)的斑节对虾(Penaeus monodon)中被发现，2009年被正式命名和报道 [16] ，随后，东南亚地区各国家也相继报道了该病害 [17] [18] 。EHP会造成对虾肝胰腺大面积损伤，阻碍对虾对营养物质的吸收，使其生长缓慢甚至停滞 [19] 。自2013年EHP传入中国后，各地区养殖的凡纳滨对虾先后出现EHP感染，感染率居高不下 [20] 。本研究将测序得到的EHP基因序列与NCBI中不同国家注册的EHP孢壁蛋白1进行比较分析，发现本文所述EHP相关基因与泰国、印度、印度尼西亚以及马来西亚EHP分离株孢壁蛋白1聚为一支，亲缘关系最近，而与中国分离株亲缘关系稍远。由此推测，本研究中凡纳滨对虾感染的EHP也许并非养殖场内部环境存在EHP病原感染所致，可能是经外省市购买的虾苗本身携带EHP病原，或用于孵化该批虾苗的亲虾由外部地区引进时携带病原产生的垂直传播造成的。同时也提示，在进口或跨省调运亲虾和虾苗的过程中一定要做好产地检疫工作，最大限度地防止外来毒株在我国各地区传播。
对虾传染病肌肉坏死病(Infectious myonecrosis, IMN)于2002年首次在巴西发现 [21] ，感染的对虾腹部末端及尾扇出现肌肉发白坏死的症状，致病原最终确定为IMNV [22] 。该病发病慢，呈缓慢死亡，但累计死亡率较高，能够达到70%以上。自巴西养殖的凡纳滨对虾发病后，很快就蔓延到印度尼西亚等国家 [21] 。我们查阅了相关文献，结合本实验室常年对天津地区凡纳滨对虾的监测数据，显示天津地区截至2022年8月之前还未检测到该病原。2022年12月天津滨海新区对虾工厂化养殖场发现的发病凡纳滨对虾为本地区发现的首例IMN感染病例。本次IMNV基因序列的系统进化树分析结果表明，该序列与已在NCBI上发布的巴西分离株、印度尼西亚分离株以及印度分离株基因序列亲缘关系近，且各序列之间的保守性很高。因此，开展中国大陆主要凡纳滨对虾养殖地区对虾肌坏死病流行病学调查，开发简便易行的病原检测试剂盒，了解该病主要传播途径等工作已刻不容缓，将对预防该病具有积极的意义，目前本实验室针对IMN的病理学分析和防控措施的研究正在同步进行。
在一定条件下，对虾经常会感染多种病原，Manivannan S等人首次报道了一印度养殖场中的斑节对虾幼体同时受到了杆状病毒(Bacu Loviruspenaei, BP)、肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovius, HPV)和WSSV共三种病原的感染 [23] 。王博雅等报道了辽宁地区某养殖场内凡纳滨对虾同时感染了IHHNV、WSSV、TSV和EHP等四种病原 [24] 。Selvin和Lipton报道在大量暴发WSSV的养殖对虾体内分离出强毒力的溶藻弧菌，证明了WSSV浸染患病的对虾很容易受到弧菌等致病菌的二次感染 [25] 。这些报道都说明了存在多种病原体共同感染对虾的情况，包括病毒与病毒、病毒与细菌、病毒与寄生虫的共感染。本研究中养殖对虾存在IMNV与EHP共感染的现象，这与Jithendran KP等在对印度东海岸沿线的对虾养殖场进行调研的发现十分相似，绝大部分养殖场也存在IMNV、EHP共感染的现象 [26] 。这种多种病原共感染的机制现在普遍认为是由于在感染一种病毒之后，虾体免疫力下降继而导致细菌、寄生虫等病原菌的二次感染，因此本研究中对虾IMNV和EHP共感染现象也可能是由于虾苗引进过程中携带IMNV，摄食、游泳等能力下降，加剧了虾体免疫力下降，又在养殖过程中感染了EHP，出现了体长大小不均一、肌肉白浊等症状。这也提示我们，在进行对虾病害防治工作中应对多种病原采取综合防控措施。
5. 结论
本文采用流行病学调查、细菌分离鉴定、寄生虫观察以及分子生物学方法对天津滨海新区2022年12月出现的患病凡纳滨对虾致病原进行研究分析，确认此次凡纳滨对虾为EHP和IMNV核酸阳性，可能是由EHP、IMNV共同感染导致，此案例为天津地区发现的首例传染性肌肉坏死病感染病例，应引起广大科研工作者和对虾养殖业者的高度重视。