银黄清肺胶囊对鼻病毒作用的体外实验研究

Experimental Study on the Effect of Yinhuang Qingfei Capsule on Rhinovirus in Vitro

摘要: 目的：观察银黄清肺胶囊对鼻病毒导致细胞病变的抑制作用。方法：以利巴韦林为对照药，接种鼻病毒R14型于HEL细胞，采用细胞病变抑制法(CPE)，观察银黄清肺胶囊体外对呼吸道鼻病毒作用。结果：银黄清肺胶囊在5.0 mg/mL和2.5 mg/mL浓度下均能完全抑制鼻病毒R14型对HEL细胞的病变，对鼻病毒R14型无预防作用，其疗效为抑制作用 > 治疗作用 > 预防作用。病毒直接杀伤作用试验中发现，5.0 mg/mL与1.0 mg/mL的银黄清肺胶囊对病毒的滴度无明显抑制作用。结论：银黄清肺胶囊对鼻病毒有较好的抑制作用，以及一定的治疗作用，其对病毒的抑制作用不是通过对病毒直接杀伤作用实现的，可能与改变受体细胞膜通道或与病毒竞争性结合膜受体，从而影响病毒的入侵过程以发挥抑制病毒复制的作用有关。

Abstract: Objective: To observe the inhibitory effect of Yinhuang Qingfei Capsule on cytopathic effect induced by Rhinovirus. Methods: Using ribavirin as a control drug, Rhinovirus R14 was inoculated into HEL cells, and cytopathic inhibition (CPE) was used to observe the effect of Yinhuang Qingfei Capsule on respiratory Rhinovirus in vitro. Yinhuang Qingfei Capsule can completely inhibit the pathological changes of Rhinovirus 14 to HEL cells at the concentrations of 5.0 mg/mL and 2.5 mg/mL, and has no preventive effect. The curative effect is inhibition > therapeutic effect > preventive effect. In the direct killing test of the virus, it was found that 5.0 mg/mL and 1.0 mg/mL of Yinhuang Qingfei Capsule had no significant inhibitory effect on the titer of the virus. Conclusion: Yinhuang Qingfei Capsule has a good inhibitory effect on Rhinovirus and a certain therapeutic effect. Its inhibitory effect on the virus is not achieved by direct killing of the virus, and may be related to changing the receptor cell membrane channel or competing with the virus to bind to the membrane receptor, thereby affecting the invasion process of the virus to play a role in inhibiting viral.

1. 引言

鼻病毒(Rhinovirus, RhV)是引起人类病毒性呼吸道感染最主要的病毒性病原体之一，上呼吸道感染30%~50%由人鼻病毒引起。它不仅能引起普通感冒以及急慢性支气管炎、社区获得性肺炎、急性下呼吸道感染、婴儿病毒性毛细支气管炎等呼吸系统感染疾病 ‎[1] ‎[2] ‎[3] ‎[4] ，目前很多证据还表明它与哮喘的恶化、慢性阻塞性肺病的急性加重等有关 ‎[5] ‎[6] ，近年来逐步成为病毒学研究的热点之一。鼻病毒为小RNA病毒，目前发现至少有100多种亚型，疫苗的研制难度较大。目前尚没有能有效阻止和治疗RhV感染的药物，现有的抗RhV感染药物均为对症治疗 ‎[7] ，干扰素、衣壳蛋白成分、受体阻滞剂等，暂未达到理想效果 ‎[8] 。银黄清肺胶囊为由蜜麻黄、葶苈子、浙贝母、苦杏仁、一枝蒿等药味采用现代工艺制成的中药三类新药，能清热化痰、止咳平喘，用于慢性支气管炎急性发作之痰热壅肺证 ‎[9] 。已有研究显示，其具有体外抗呼吸道合胞病毒、流感病毒作用 ‎[10] ‎[11] ，并对幼龄大鼠流感病毒肺炎具有较好的保护作用 ‎[12] 。本研究采用细胞培养技术、MTT染色法及CPE法，对银黄清肺胶囊在人胚肺二倍体细胞HEL中对RhV14型的作用进行研究，以观察银黄清肺胶囊在体外对RhV作用，为进一步研究该药的抗不同类型病毒作用机制提供实验基础。

2. 实验材料

2.1. 药物

银黄清肺胶囊，为湖南安邦制药股份有限公司提供。药物成份：北葶苈子、炙麻黄、苦杏仁、浙贝母、枇杷叶、大青叶、石菖蒲、穿山龙、一枝蒿、银杏叶、五味子、枳实、生石膏、甘草。辅料：淀粉、硬脂酸镁。其性状为硬胶囊，内容物为黄棕色颗粒，味苦。生产批号：201203，批准文号：国药准字Z20020075，规格：0.15 g/粒，24粒/盒。

选择利巴韦林为阳性对照药，由广东肇庆鼎湖药业有限公司生产，20200825。

2.2. 细胞与病毒

人胚肺二倍体细胞HEL，购自武汉典藏中心。经广州中医药大学热带医学研究所传代保种，实验时为传代p3代。

鼻病毒14型：为广州中医药大学热带医学研究所冻存保种，TCID₅₀ = 4.67。

2.3. 仪器与试剂

DMEM (GIBCO公司，12800-017)；胎牛血清(美国GIBCO公司，10099-141)；6500型CO₂恒温培养箱(NAPCO)；CK-40倒置显微镜(日本OLYMOUS)；ELx800酶标仪(美国Bio-tek)。

3. 方法

3.1. 样品前处理 ‎[13]

精密称取样品1.0262 g，用足量三蒸水充分浸泡溶胀后置于60℃水浴2小时后离心，取上清液后隔水蒸腾浓缩至母液浓度为500 mg/mL。母液以间歇灭菌法除菌(80℃水浴30分钟，连续3日)，离心分装冻于−20℃备用。

阳性药物利巴韦林：精密称取利巴韦林粉末0.0524 g，用无菌培养基DMEM 5.2 mL充分溶解后，0.22 mm过滤除菌分装冻于−20℃备用，母液浓度为10 mg/mL。

3.2. 银黄清肺胶囊细胞毒性试验 ‎[14]

在96孔培养板内，每孔加入(5 × 10³个/mL)的细胞(HEL)，37℃ 5% CO₂培养，待细胞长成单层后，另加入系列稀释的不同浓度银黄清肺胶囊(40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 5.0 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL)。逐日观察细胞病变，培养4 d后则终止实验，受试样品对细胞的毒性作用通过MTT染色法进行测定。并计算出药物的半数毒性浓度(TC₅₀)。试验时设阳性药对照、正常细胞对照。见图1。

(a) (b) (c) (d) (e)

Figure 1. Toxic effect of Yinhuang Qingfei Capsule on human embryo lung diploid cells ((a)~(c) respectively 5.0 mg/mL, 2.5 mg/mL and 1.25 mg/mL of Yinhuang Qingfei Capsule; (d) 2.0mg/mL of ribavirin; (e) normal HEL cells)

图1. 银黄清肺胶囊在人胚肺二倍体细胞上的毒性作用((a)~(c) 分别为银黄清肺胶囊5.0 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL；(d) 为利巴韦林2.0 mg/mL；(e) 为正常HEL细胞)

3.3. 银黄清肺胶囊体外对鼻病毒14型的预防、抑制、治疗作用、直接杀伤作用 ‎[15] ‎[16] ‎[17] ‎[18]

3.3.1. 预防作用模式

常规消化HEL细胞，用完全培养基调整接种密度至5.0 × 10⁵个/mL，以0.1 mL/孔接种于96孔一次性培养板上，37℃、5% CO₂培养至紧密单层后备用。经前期对银黄清肺胶囊毒性作用的初筛，根据半数毒性浓度(TC₅₀)结果分别选取浓度10 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL作为实验对象。先将稀释好的药物接种于96孔细胞板上，每个样品浓度接种4个细胞复孔，使样品先与受体细胞作用24小时。次日，接种100 TCID₅₀病毒悬液100 mL继续培养4天，35℃、5% CO₂。同时设置阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照，实验结束后以显微镜观察细胞病变法(CPE法)评价受试样品对病毒的抑制作用。见图2。

(a) (b) (c)

Figure 2. The therapeutic effect of Yinhuang Qingfei Capsule on Rhinovirus in human embryo lung diploid cells ((a) and (b) are 2.5 mg/mL and 1.25 mg/mL of Yinhuang Qingfei Capsule respectively; (c) is 2.0 mg/mL of ribavirin)

图2. 银黄清肺胶囊在人胚肺二倍体细胞上对鼻病毒的治疗作用((a) (b)分别为银黄清肺胶囊2.5 mg/mL、1.25 mg/mL；(c)为利巴韦林2.0 mg/mL)

3.3.2. 抑制作用模式

常规消化HEL细胞，用完全培养基调整接种密度至5.0 × 10⁵个/mL，以0.1 mL/孔接种于96孔一次性培养板上，37℃、5% CO₂培养至紧密单层后备用。选取浓度10 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL作为银黄清肺胶囊的实验浓度。先将稀释好的药物接种于96孔细胞板上，每个样品浓度接种4个细胞复孔，加样后直接接种100 TCID₅₀病毒悬液100 mL继续培养4天，35℃、5% CO₂。同时设置阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照，实验结束后以显微镜观察细胞病变法(CPE法)评价受试样品对病毒的抑制作用。见图3。

(a) (b) (c)

Figure 3. Inhibitory effect of Yinhuang Qingfei Capsule on Rhinovirus 14 on human embryo lung diploid cells ((a) and (b) are 2.5 mg/mL and 1.25 mg/mL of Yinhuang Qingfei Capsule respectively; (c) is 2.0 mg/mL of ribavirin)

图3. 银黄清肺胶囊在人胚肺二倍体细胞上对鼻病毒14型的抑制作用((a) (b) 分别为银黄清肺胶囊2.5 mg/mL、1.25 mg/mL；(c) 为利巴韦林2.0 mg/mL)

3.3.3. 治疗作用模式

常规消化HEL细胞，用完全培养基调整接种密度至5.0 × 10⁵个/mL，以0.1 mL/孔接种于96孔一次性培养板上，37℃、5% CO₂培养至紧密单层后备用。先将100 TCID₅₀的病毒悬液攻击HEL细胞，病毒攻击2小时后分别加入受试浓度为40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL、2.5 mg/mL和1.25 mg/mL的银黄清肺胶囊培养基。每个样品浓度接种4个细胞复孔，继续培养4天，33℃~35℃、5% CO₂。同时设置阳性药物利巴韦林对照、病毒对照和正常细胞对照，实验结束后以显微镜观察细胞病变法(CPE法)评价受试样品对病毒的抑制作用。见图4。

(a) (b) (c) (d) (e)

Figure 4. The preventive effect of Yinhuang Qingfei Capsule on Rhinovirus type 14 in HEL cells ((a)~(c) Yinhuang Qingfei Capsule 2.5 mg/mL, 1.25 mg/mL, ribavirin 2.0 mg/mL; (d) virus control, (e) normal HEL cell control)

图4. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上对鼻病毒14型的预防作用((a)~(c) 依次为银黄清肺胶囊2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、利巴韦林2.0 mg/mL；(d) 为病毒对照，(e) 为正常HEL细胞对照)

3.3.4. 直接杀伤作用模式

选取完全无毒浓度5 mg/mL、1 mg/mL的银黄清肺胶囊作为实验对象。将100 TCID₅₀的病毒悬液与等量的受试样品充分混合后，置33℃作用过夜。次日，将混合物进行10倍系列稀释：10⁻¹~10⁻⁶接种于96孔细胞板上，置33℃继续培养4天。实验终止时镜下观察CPE评价受试样品对病毒滴度的影响。实验过程同时设置利巴韦林对照组、病毒对照组。

3.4. 统计学处理

采用SPSS 19.0统计软件分析数据，计量资料以( $\bar{x}\pm s$ )表示，多组间比较，当资料满足正态分布且组间方差齐时，应用单因素方差分析；如不满足上述条件则采用非参数检验(秩和检验)，检验水准为α = 0.05。

4. 实验结果

4.1. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上的毒性作用(MTT染色法)

根据MTT染色读取其在λ490下的吸光值，计算银黄清肺胶囊各浓度下对细胞的毒性作用和半数毒性浓度。

银黄清肺胶囊在HEL细胞上的半数毒性浓度为5.22 mg/mL，在2.5 mg/mL和1.25 mg/mL浓度下对HEL细胞的毒性作用分别为14.67%、10.67%。利巴韦林最大实验浓度2.0 mg/mL浓度对HEL细胞的毒性作用为33.33%。见表1。

Table 1. Toxic effects of Yinhuang Qingfei Capsules on HEL cells (MTT staining method)

表1. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上的毒性作用(MTT染色法)

4.2. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上抗鼻病毒14型的作用(CPE法)

银黄清肺胶囊其治疗作用在低毒浓度2.5 mg/mL时能阻止85%~90%细胞出现CPE、在无毒浓度1.25 mg/mL时能阻止60%细胞出现CPE；对病毒的抑制作用中在半数毒性浓度5.0 mg/mL和低毒浓度2.5 mg/mL浓度下均能完全抑制病毒的复制。但对鼻病毒14型无预防作用。其疗效分别为抑制作用 > 治疗作用 > 预防作用。见表2。

Table 2. Effect of Yinhuang Qingfei Capsule on Rhinovirus 14 in HEL cells (CPE method)

表2. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上对鼻病毒14型的作用(CPE法)

注：“Θ”表示样品对细胞具有毒性作用，造成细胞破碎、固缩等；“−”无毒、无病变；细胞病变程度“−” < 10%，“+”25%，“++”50%，“+++”75%，“++++” > 90%。

4.3. 银黄清肺胶囊在HEL细胞上对病毒的直接杀伤作用(CPE法)

结果显示：银黄清肺胶囊与病毒混合液作用12 h后未能使鼻病毒的感染力明显减弱，其感染滴度与未加药的病毒对照组均在6.0，而阳性对照药利巴韦林感染滴度为3.67，银黄清肺胶囊对鼻病毒14型无直接杀伤作用。

5. 讨论

鼻病毒是引起人类病毒性呼吸道感染的最常见病原体。现代研究表明，呼吸道上皮细胞是RhV感染的靶细胞。RhV与呼吸道上皮细胞的特异性受体即细胞间黏附因子(Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)相结合，在呼吸道上皮细胞及局部淋巴组织中复制，引起炎症反应 ‎[19] ‎[20] 。鼻病毒感染也是COPD急性加重的最常见病毒原因，约占病毒急性加重的60%，它会抑制患者巨噬细胞对细菌的吞噬作用，引起继发性细菌感染，加重病情 ‎[21] 。

本研究结果显示，银黄清肺胶囊在人胚肺二倍体细胞HEL上的半数毒性浓度TC₅₀为5.22 mg/mL，最小实验浓度1.25 mg/mL浓度下对HEL细胞的毒性仅为10.67%。在观察受试样品对鼻病毒14型的作用中发现：银黄清肺胶囊和人胚肺二倍体细胞HEL共培养再感染病毒14型细胞不能抑制病毒感染；其治疗作用模式即先感染病毒再加药物在2.5 mg/mL下对病毒有85%~90%的抑制作用；对病毒的抑制作用中在5.0 mg/mL和2.5 mg/mL浓度下均能完全抑制鼻病毒14型对HEL细胞的病变。其疗效分别为同时作用模式 > 治疗作用模式 > 预防作用模式。在对病毒直接杀伤作用中发现，5.0 mg/mL与1.0 mg/mL的银黄清肺胶囊对病毒的滴度无明显抑制作用。

银黄清肺胶囊是由麻黄、葶苈子、大青叶、银杏叶、一枝蒿、枇杷叶等14味中药经现代提取制剂工艺制备而成的天然复方制剂。已有研究结果显示，该药药味以及主要成分具有抗病毒作用。不同剂量组麻黄提取物(2.56 mg/mL、3.2 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL，4个剂量组)在感染8小时内，对呼吸道合胞病毒侵入和吸附过程均有明显的抑制作用 ‎[22] 。大青叶、其水提液以及其主要有效成分靛玉红对甲型流感病毒、单纯性疱疹病毒、柯萨奇病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒、登革病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒等有明显的抑制感染和抑制增殖作用 ‎[23] ‎[24] ‎[25] 。银杏叶的有效成分槲皮素既有抗病毒感染活性，又有抗复制活性，可以拮抗钙离子通道，使病毒受体复合物不能进入细胞，中断其生活周期，从而引起病毒死亡，它对甲型流感病毒(H₁N₁)、登革病毒2型(DV₂)、柯萨奇B病毒(CVB₃)以及呼吸道合胞病毒(RSV-A)等均有抑制作用 ‎[26] ‎[27] ‎[28] 。一枝蒿抗病毒作用的主要有效成分为一枝蒿酮酸 ‎[29] ‎[30] 。银黄清肺胶囊HPLC指纹图谱研究以及HPLC-Q-TOF-MS/MS研究结果显示，麻黄碱、靛玉红、槲皮素、一枝蒿酮酸等为该药的药效物质基础成分 ‎[31] ‎[32] 。

从以上可知，银黄清肺胶囊对鼻病毒有较好的抑制作用，其对病毒的抑制作用不是通过对病毒直接杀伤作用实现的，推断可能与改变受体细胞膜通道或与病毒竞争性结合膜受体从而影响病毒的入侵过程，以发挥抑制病毒复制的作用有关。这为今后更广泛地应用该药治疗呼吸道感染提供了药理依据，也为进一步探索其抗病毒作用机制提供思路。

基金项目

湖南省科技厅：湖南省经典名方工程技术研究中心(2018TP2034)。

NOTES

^*通讯作者。