1. 引言
维兰特罗(vilanterol, (R)-4-[2-[[6-[(2,6-二氯苄基)氧基]-乙氧基]乙基]氨基]-1-羟基乙基]-2-羟基乙基]-2-羟甲基苯酚)是由葛兰素史克(GSK)公司研发的一种新型长效β2-肾上腺素受体(β2-AR)激动剂，能够舒张支气管平滑肌，作为支气管扩张剂用于慢性阻塞性肺疾病的治疗。维兰特罗由于受体亲和力、选择性以及体内活性均优于其它特罗类药物 [1] [2] [3] ，其临床使用率高。
GSK公司于2005年公开维兰特罗的合成工艺 [4] [5] ，其后，Laurus实验室及其它机构相继对维兰特罗及其关键中间体的合成路线进行优化 [6] - [11] ，其降低了成本，更易于工业化生产。在维兰特罗现有合成工艺中，(5R)-5-(2,2-二甲基-4H-1,3-苯并二氧杂环己烯-6-基)-1,3噁唑烷-2-酮(6)是关键中间体之一，该中间体多由水杨醛或2-溴-1-(2,2-二甲基-4H-1,3-苯并二氧杂环己烯-6-基)乙酮(GSK报道)为起始原料经过一系列反应而得，存在合成步骤长或原子经济性偏低等问题。安徽德信佳生物医药公司开发了一条由维兰特罗中间体5 (图1) 2-(2,2-二甲基-4H-1,3-苯并二氧杂环己烯-6-基)-2-羰基乙基氨基甲酸叔丁酯经环合反应得到中间体6的绿色制备工艺 [12] (图1)。该工艺在一定程度上能提升反应专一性，提高产率，并且实现了催化剂回收套用，减轻了环保压力，符合现代绿色工业化生产的要求。
Figure 1. Synthesis process of vilanterol and its key intermediates
图1. 维兰特罗及其关键中间体合成工艺
维兰特罗原料药的质量控制须从关键中间体及其有关物质(杂质)入手。由于原材料生产厂家、中间体生产工艺等因素影响，维兰特罗中间体5成品中存在2~3个液相色谱杂质峰 [13] ，这些杂质有可能会伴随着进入下一步工序，并残留在最终产品维兰特罗中。为保证药物的有效和安全性，建立维兰特罗中间体5含量测定方法以及对有关物质定性定量分析尤为重要。HPLC法对原料药(或中间体)及其有关物质能够实现较好的分离和测定 [14] [15] [16] ；借助液质联用技术(LC-MS)可以实现有关物质结构推测 [17] 。
维兰特罗中间体5主成分的峰面积纯度约为98.5%，3个杂质峰面积之和为1.0%~1.5% [13] ，考虑到主成分的定量和杂质的定性定量检测，本文采用半制备或制备型高效液相色谱对关键中间体5及其杂质进行分离，一方面获得高纯中间体5作为定量分析的对照品，另一方面，杂质也得到了富集，可更方便地用于后续的结构分析，这为工艺优化及关键中间体的质量控制提供理论和方法支撑。
2. 材料与仪器
2.1. 试药
维兰特罗中间体5 (安徽德信佳公司合成，峰面积纯度约为98.5%)、磷酸二氢钾(广东汕头市西陇化工厂)、磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、纯化水(娃哈哈集团)、甲醇(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)、乙腈(色谱级，国药集团化学试剂有限公司)、微孔滤膜(孔径0.45/0.22 μm，上海兴亚净化材料厂)、有机滤头(尼龙66，0.22 μm，津腾)、一次性使用无菌注射器(河南曙光汇知康生物科技有限公司)。
2.2. 仪器
Agilent 1260高效液相色谱仪(配二元泵、在线脱气机、自动进样器)系列；C18纳谱分析柱(250 × 4.6 mm, 5 μm)；LC-20A岛津制备色谱仪；C18纳谱制备柱(250 × 21.2 mm, 5 μm)；C18纳谱半制备柱(250 × 10 mm, 5 μm)；液相色谱–四级杆静电场轨道阱质谱联用仪(Vanquish Q Exactive Plus，德国赛默飞世尔公司)；MTN-2800W氮吹浓缩装置(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；PHS-25 pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；PWN124ZH/E精密电子天平(奥豪斯仪器有限公司)。
3. 方法与结果
3.1. 中间体5提纯
3.1.1. 分析色谱条件
C18纳谱分析柱(250 ×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，等度洗脱(80% A)；流速1.0 mL∙min−1；检测波长220 nm；柱温30℃；采集时间：10 min；进样体积为20 μL。
3.1.2. 制备色谱条件
C18纳谱制备柱(250 × 21.2 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)，等度洗脱(80% A)；流速6.0 mL∙min−1；检测波长220 nm；柱温30℃；采集时间：20 min；进样体积为2 mL。
3.1.3. 中间体5的制备色谱提纯
称取维兰特罗中间体5合成品20.0 mg，加流动相10 mL溶解为浓度2.0 mg∙mL−1的溶液，过膜，依据“3.1.2”条件进行制备色谱分离，按照不同成分出峰时间划分收集时间段，用试管分段收集0~2 min、2~4 min、4~6 min、6~8 min、8~10 min、10~11 min、11~13 min、13~18 min时间段内的洗脱液，各段洗脱液依据“3.1.1”条件下进行HPLC分析，依次确定各段洗脱液中主成分纯度，将纯度达到99.5%左右的洗脱液合并，氮吹浓缩，重复以上制备操作多次，获得可用于含量测定所用的中间体5高纯对照品。
对三批次中间体5合成品及制备色谱进一步提纯得到的中间体5对照品进行HPLC检测，如图2所示，三批次中间体5合成品的出峰情况基本吻合，主成分(RT 4.53 min)峰面积纯度为98.5%~99.0%，杂质I (RT 1.47 min)为0.4%~0.5%，杂质II (RT 2.34 min)为0.1%~0.2%；中间体5对照品的峰面积纯度由合成品中98.5%提高至99.5%以上，可用于中间体5含量测定方法建立所用的对照品。
Figure 2. Chromatographic comparison map of intermediate 5 complexes before and after purification by preparation chromatography: A (Reference product after preparation chromatography purification); B (YL-5001); C (YL-5002); D (YL-5003)
图2. 中间体5合成品通过制备色谱提纯前后的色谱对比图：A (制备色谱纯化后对照品)；B (YL-5001)；C (YL-5002)；D (YL-5003)
3.2. 中间体5含量测定方法
3.2.1. 溶液配制
对照品储备液：称取2.1项下所得中间体5对照品适量，精密称定，加入流动相溶解，配成1.0 mg∙mL−1的溶液。
供试品储备液：称取中间体5合成品适量，精密称定，加入流动相溶解，配成1.0 mg∙mL−1的溶液。
阴性对照溶液：取流动相适量，作阴性对照溶液。
对甲苯磺酸储备液：称取对甲苯磺酸标品适量，精密称定，加入流动相溶解，配成1.0 mg∙mL−1的溶液。
3.2.2. 色谱分析条件
色谱条件同3.1.1。
3.2.3. 方法学验证
系统适应性实验：取对照品储备液、供试品储备液用流动相稀释成0.1 mg∙mL−1的溶液，与阴性对照溶液在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测。
结果显示，中间体5对照品(B)色谱图基线平稳、峰型较好(图3)，其保留时间为4.53 min，空白洗脱剂溶液(A)和供试品溶液(C)中其它有关物质均不干扰中间体5的测定，故“3.1.1”条件系统适应性好。
Figure 3. HPLC chromatogram map of blank solvent (A), reference product of intermediate 5 (B), and test product (C)
图3. 空白溶剂(A)、中间体5的对照品(B)、供试品(C)的高效液相色谱图
线性关系取对照品储备液至容量瓶用流动相定容，分别配制浓度为0.005 mg∙mL−1、0.02 mg∙mL−1、0.05 mg∙mL−1、0.08 mg∙mL−1、0.1 mg∙mL−1的溶液，作系列线性溶液，在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，纵坐标(Y)为测得峰面积，横坐标(X)为溶液浓度，拟合线性回归方程。
中间体5含量检测的线性方程为Y = 38705X + 21.565，R2 = 0.9998，结果表明，中间体5对照品在0.005 mg∙mL−1至0.1 mg∙mL−1浓度范围内线性关系良好。
定量限和检测限：取线性关系测定中最低点浓度以流动相逐级稀释，在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，以S/N (信噪比) = 3的浓度作为检测限，S/N (信噪比) = 10的浓度作为定量限。中间体5对照品定量限为0.625 mg∙mL−1，检测限为0.156 mg∙mL−1。
重复性试验：取供试品储备溶液，用流动相将其制备成6份浓度为0.02 mg∙mL−1的样品溶液，在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，外标法计算含量，以标示量百分数表示，计算RSD值，结果为RSD = 0.29%，小于2.0%，表明本方法重复性好。
稳定性试验：分别取同一供试液样品与对照品，冰箱冷藏各放置0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h后在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，供试品和对照品峰面积变化RSD%均不超过2.0%，表明供试品与对照品溶液在12 h内稳定。
加标回收率试验：取已知含量的供试品溶液，作为供试样品溶液，并取对照品适量加入至供试样品溶液，分别配成低、中、高浓度的回收率样品溶液，各浓度分别平行三次。在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测供试样品溶液与回收率样品溶液，计算加标回收率。
结果显示，平均回收率为102.45%，RSD < 2.0%，表明该方法准确度良好，结果如表1。
Table 1. Test results of recovery rate
表1. 回收率试验结果
3.3. 中间体5相关杂质分析
3.3.1. 中间体5合成品直接进行液质联用分析
液质联用条件：C18纳谱分析柱(250 × 4.6 mm, 5 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，等度洗脱(80% A)；流速1.0 mg∙mL−1；检测波长220 nm；柱温30℃；采集时间：10 min；进样体积为40 μL，液相色谱–静电场轨道阱质谱联用仪。
在以上条件下，将浓度为0.02 mg∙mL−1中间体5合成品通过LC-MS进行分析。
根据质谱图分析，RT 2.82 min质谱图(图4(a)) [M-H]−准确离子质量为280.1183，与中间体4合成品质谱图(图4(b))相对应，推测RT 2.82 min为中间体4。
3.3.2. 中间体5中相关杂质的制备分离
半制备色谱条件：C18纳谱半制备柱(250 × 10 mm, 5 μm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，等度洗脱(80% A)；流速2.0 min∙mL−1；检测波长220 nm；柱温30℃；进样体积为2 mL。
称取维兰特罗中间体5合成品5.0 mg，加流动相10 mL配为浓度0.5 mg∙mL−1的溶液，过膜，依据“3.1.2”所示条件进行制备色谱分离，按照不同成分保留时间划分收集时间段，用试管收集0~2 min、2~4 min、4~6 min、6~8 min、8~10 min、10~11 min、11~13 min、13~18 min时间段内的洗脱液，各段洗脱液依据“3.1.1”条件下进行HPLC分析，依次确定各段洗脱液中杂质峰组成及相对比例，对比确定杂质集中出现且相对含量较高的分段，重复以上制备操作多次，确保洗脱段的结果重现，并可富集用于定性分析。
(a) 
(b)
Figure 4. Comparison of synthetic quality spectra between impurity segment and intermediate 4
图4. 杂质段和中间体4合成品质谱图对比
3.3.3. 杂质结构分析
1) 制备色谱分离的杂质结构分析
将富集得到的中间体5的杂质浓缩液在“3.3.1”条件下，利用液质联用仪(Vanquish Q Exactive Plus)进行分析，借鉴丁亚婷等人在研究有关物质时，通过质谱对各个杂质的结构分析方法，借助离子碎片信息能较为准确地确定其结构 [18] ，本研究在质谱分析的基础上，结合杂质段与其相应对照品的HPLC保留时间对比，进一步确证其结构准确性。
(a) 
(b)
Figure 5. Mass spectra of possible impurities
图5. 可能的杂质的质谱图
经液质联用分析RT 1.47 min左右的[M-H]−准确离子质量m/z = 171.1029 (图5(a))，可能为中间体5中存在的杂质，根据中间体5合成工艺，推测其为对甲苯磺酸。在质谱分析中还检测到RT 2.82 min (图5(b))，结合合成工艺与质谱图[M-H]−准确离子质量m/z = 280.1186，推断杂质段存在少量中间体4。
将对甲苯磺酸对照品(A)制成与6~8 min杂质段样品(B)浓度相近的样品，在“3.1.1”色谱条件下进样检测，进行峰保留时间对比，(B)中主峰保留时间与对应的(A)主峰保留时间一致，故进一步确认中间体5中杂质I (RT 1.47 min)为对甲苯磺酸。
将中间体4合成品(C)制成与6~8 min杂质段样品(B)浓度相近的样品，在“3.1.1”色谱条件下检测，进行峰保留时间对比，(B)中存在保留时间与(C)主峰保留时间一致的峰，故进一步确证中间体5中杂质III (RT 2.82 min)为中间体4。
经LC-MS技术下的质谱分析和HPLC保留时间对比，判断RT 1.47 min (杂质I)为对甲苯磺酸，RT 2.82 min (杂质III)为中间体4，并且通过含量对比，判定原料药中中间体4残留的极少量。
3.4. 中间体5及有关物质含量测定
3.4.1. 中间体5含量测定
将6批中间体样品配制成0.02 mg∙mL−1，在“3.1.1”色条件下用HPLC检测，根据线性方程(Y = 38705X + 21.565)计算各批次含量，结果如表2。
3.4.2. 杂质含量测定
不加校正因子的自身对照法：配制浓度为0.25 mg∙mL−1的6批供试品溶液，并且取一定量稀释100倍，作为对照品溶液，每批样品平行3次，在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，依据不加校正因子的自身对照法，计算杂质含量。结果如表2。
加校正因子的自身对照法 [18] ：取对甲苯磺酸储备液，分别配制浓度为0.005 mg∙mL−1、0.02 mg∙mL−1、0.05 mg∙mL−1、0.08 mg∙mL−1、0.1 mg∙mL−1的溶液，作系列线性溶液，在“3.1.1”色谱条件下用HPLC检测，纵坐标(Y)为测得峰面积，横坐标(X)为溶液浓度，拟合线性回归方程。校正因子(f) = r1 (中间体5)/r2 (杂质I) (r为线性方程斜率)，据此测定校正因子(f)，计算杂质的含量。结果如表2。
Table 2. Determination of the content of active ingredients and impurities in 6 batches of intermediate 5
表2. 6批次中间体5中有效成分及杂质含量测定
4. 讨论
4.1. 中间体5 HPLC测定以及提纯洗脱条件
中间体5以及其提纯的色谱采用乙腈或甲醇与水、磷酸二氢钾缓冲盐洗脱体系对中间体5进行分析，其液相色谱如图6所示，乙腈/水或缓冲盐(A、B、C)以及甲醇/缓冲盐(E)体系下中间体5都可以获得较好分离，除主成分色谱峰外，还有2~3个峰形较规则的杂质峰；在甲醇/水体系(D)下洗脱，基线漂移，且杂质峰形不规则。另外，考虑到后续制备色谱分离时，分段收集的洗脱液需进行液质分析或浓缩保存作为对照品使用。若用实验室之前的实验体系“乙腈或甲醇–缓冲盐洗脱体系” [14] ，则洗脱液中缓冲盐无法除去，影响质谱分析和对照品的制备，因此，选择乙腈/水 = 80:20作为后续HPLC定性、定量分析和制备色谱条件。
Figure 6. Effects of different mobile phase compositions and proportions on the separation effect of intermediate 5 and its impurities: A (acetonitrile:water = 80:20); B (acetonitrile:water = 70:30); C (acetonitrile:potassium dihydrogen phosphate buffer = 70:30); D (methanol:water = 80:20); E (methanol:potassium dihydrogen phosphate buffer = 80:20)
图6. 不同流动相组成及比例对中间体5及其杂质分离效果的影响：A (乙腈:水 = 80:20)；B (乙腈:水 = 70:30)；C (乙腈:磷酸二氢钾缓冲盐 = 70:30)；D (甲醇:水 = 80:20)；E (甲醇:磷酸二氢钾缓冲盐 = 80:20)
4.2. 杂质的结构分析
通过中间体5合成品直接进行液质联用分析，推测中间体5中存在中间体4，但通过HPLC色谱图RT 1.47 min、RT 2.34 min有较明显杂质峰，推测直接对中间体5合成品进行LC-MS分析具有一定的局限性，基质干扰对杂质检测影响较大，所获得的杂质信息有限，故考虑通过制备或半制备色谱分离出各杂质段，从而对各杂质进行全面分析。
根据制备或半制备色谱各杂质收集段HPLC图对比，在各段收集中6~8 min段浓度较大，且分离的杂质除主要杂质峰(RT 1.77 min，其样品浓度越低，保留时间随之前移，与中间体5中RT 1.47 min能够对应)外，还有其他吸收较小的峰，结果如图7所示，对其进行分析，有利于对杂质部分进行全面分析，以测定除主要杂质外，其他含量较少或吸收较低的成分，故对6~8 min杂质段样品进行液质联用分析。由于在各分离段未发现RT 2.34 min (杂质II)，故选择以RT 1.47 min (杂质I)为主要杂质目标。研究结合实际工业生产中所存在原料以及副产物，通过HPLC保留时间对比和LC-MS分子离子峰对比等方法进行定性分析，确证了杂质I和杂质III的结构，为中间体5的生产工艺优化提供了理论支撑。
4.3. 中间体5有关物质含量测定
杂质含量测定依据不加校正因子的自身对照法，可测得中间体5主要杂质的含量。杂质I (RT 1.47 min)已经确定其为对甲苯磺酸，在已知杂质并有杂质对照品情况下，可采取加校正因子的自身对照法，按“3.2.3”中线性关系测定方法拟合对甲苯磺酸的线性方程，其线性方程为Y = 53802X + 13.199，R2 = 0.9999，校正因子f = 0.7194，据此测定有关物质I的准确含量。
注：A (6~8 min)；B (8~10 min)；C (13~18 min)。
Figure 7. Superposition diagram of impurity segment
图7. 杂质段叠加图
5. 结论
本实验建立了一种新的检测维兰特罗中间体5及其有关物质的高效液相色谱方法，并进行了方法学验证，结果表明，该方法专属性强、灵敏度高、准确度好，并能使中间体5与有关物质进行较好的分离，利用半制备或制备色谱实现了有关物质的分离，建立了对于中间体5的纯化方法，对分离得到的有关物质进行定性和定量分析，通过LC-MS分析，对未知杂质I (RT 1.47 min)、未知杂质III (RT 2.82 min)进行定性结构分析。本研究对维兰特罗合成中的关键中间体进行了深入研究，为工艺优化、有效降低或去除杂质及关键中间体的质量控制提供理论和方法支撑。
致谢
本人作为课题主要负责人，主要负责实验操作、数据收集、整理以及分析，撰写、修改以及投出文章。在此感特别谢我的导师惠爱玲老师，对于整个课题实验方案的制订、实施以及论文撰写进行指导，感谢张文成、吴泽宇老师对我论文写作方面给予修改和指导意见，感谢谢刘婕师姐、胡庆丰师弟在实验上给予我的帮助，协助我更好地完成实验工作；感谢企业项目负责人许坤、王红磊，在我遇到问题时，结合实际工业生产中的因素对问题进行分析。
基金项目
安徽省阜阳市科技重大专项(FK20208015)。
NOTES
*通讯作者。