子宫自然杀伤细胞及其与妊娠并发症关系的研究进展

Advances in the Study of Uterine Natural Killer Cells and Their Relationship with Pregnancy Complications

摘要: 子宫自然杀伤细胞(uterine natural killer cells, uNK)作为先天免疫系统的一员，约占妊娠期淋巴细胞总数的70%，在对宿主免受病原体侵袭方面起着重要作用，并参与了一系列影响妊娠成功的生理过程。能通过分泌多种细胞因子，促进滋养层侵袭，重塑螺旋动脉，保护胎儿发育，维持正常妊娠。而失衡的uNK细胞会导致螺旋动脉重构不足和滋养层入侵受损，并与产科并发症如子痫前期、复发性流产、胎儿生长受限密切相关。本篇综述对uNK细胞及其uNK细胞在生理或病理条件下对妊娠的作用进行了介绍，为未来靶向妊娠相关并发症的治疗提供新的线索。

Abstract: Uterine natural killer cells (uNK), as a member of the innate immune system, account for about 70% of the total number of lymphocytes during pregnancy, play an important role in protecting the host from pathogens, and participate in a series of physiological processes that affect the success of pregnancy. It can promote trophoblast invasion, reshape spiral artery, protect fetal development, and maintain normal pregnancy by secreting a variety of cytokines. Unbalanced uNK cells can lead to inadequate spiral artery remodeling and impaired trophoblast invasion, and are closely associ-ated with obstetric complications such as preeclampsia, recurrent abortion, and fetal growth re-striction. This review introduces the role of uNK cells and uNK cells in pregnancy under physiologi-cal or pathological conditions and provides new clues for future therapies targeting pregnan-cy-related complications.

1. 引言

母体与胎儿之间的神秘联系一直吸引着免疫学家，并对母体为什么没有对异体基因的胎儿进行排斥提出疑问。但随着近年来主动免疫串扰的概念越来越受欢迎，使植入部位免疫系统不受抑制的观点得到了肯定 [1] 。母体上uNK细胞的受体与绒毛外滋养细胞(extravillous trophoblasts, EVT)上的配体结合能够使母胎界面发生免疫耐受，维持妊娠。胎儿细胞与母体免疫细胞是能够进行双向免疫对话的 [2] 。uNK是先天免疫系统的一员，在怀孕早期占所有免疫细胞的70%，在成功的怀孕中扮演促进滋养层侵袭、重塑螺旋动脉、保护胎儿发育的重要作用 [3] 。打破了我们对传统NK细胞只具有较强细胞毒性能够杀死炎症细胞的认识，uNK细胞似乎是实现成功着床和怀孕的必要调节因子。

2. uNK与NK细胞区别

自然杀伤细胞(nature killer cell, NK)作为免疫系统的一员，能够在未致敏的情况下自发的通过分泌细胞因子杀死病原体感染的细胞和肿瘤细胞，同时也因为拥有较强的细胞毒性而被人熟知。但不同的表型和功能将NK细胞分成不同亚群。如来自脾脏或血液循环中的常规NK (Conventional nk, cNK)细胞或外周NK细胞(Peripheral nk cells, PNK)，亦或是来自于肝脏或子宫等组织中的组织常驻NK细胞(Tissue resident nk cells, trNK)。妊娠早期随着蜕膜化的进行，有大量NK细胞聚集于子宫内称为子宫自然杀伤细胞(uNK) [4] 。在小鼠中的一些基因表达研究证明，小鼠trNK细胞专门从事组织重塑，而像PNK细胞与cNK细胞可能发挥免疫防御作用 [5] 。PNK与uNK表型不同，细胞毒力也存在差别。PNK细胞拥有较强的细胞毒性，其表型主要为CD56^dimCD16⁺，而处于子宫特殊环境中的uNK细胞表型主要为CD56^brightCD16⁻，细胞溶解活性弱，细胞毒性较差。但uNK细胞颗粒确含有细胞毒性介质如穿孔素和颗粒酶，这颗粒极化到免疫突触才导致的毒性较弱 [6] 。也有研究表明，根据其位置和宿主的妊娠状态把uNK细胞分为子宫内膜NK细胞(Endometrial nk cells, eNK)或蜕膜NK细胞(Decidua nk cell, dNK)。在未怀孕的子宫中，eNK在月经周期中更新，并参与子宫内膜蜕膜化和血管重建，为胚胎着床创造有利条件。而dNK细胞在妊娠的过程中发挥关键作用，包括母胎免疫耐受、促进外滋养细胞侵袭、推动子宫螺旋动脉重塑等 [7] [8] 。

3. uNK细胞的起源

对于uNK细胞的起源并没有共识，越来越多的证据表明uNK可能存在多个来源。一种是uNK细胞起源于寄存于子宫内膜的造血前体细胞(HPCs)，另一种是受子宫中趋化因子、细胞因子的影响，trNK细胞在子宫局部通过增值而产生uNK细胞。同样有人通过早期妊娠模型中实验诱导的一种共生实验证实了在蜕膜化的开始，也就是怀孕的早期阶段，子宫内膜重塑是由局部trNK细胞增殖引起。还存在一种是外周NK细胞通过趋化迁移至子宫和蜕膜，比如由蜕膜基质细胞、子宫内皮细胞和胎儿滋养细胞产生的特定因子，趋化因子配体12 (CXCL12)、CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL4，诱导外周NK细胞产生趋化反应，并在母体与胎儿免疫对话的环境中分化获得uNK细胞的表型与功能 [9] [10] 。

4. uNK细胞亚群及作用

dNK细胞(定位于基底蜕膜的uNK细胞)在母胎界面产生约50%~70%的免疫细胞，并在妊娠中起到重要作用。随着单细胞测序技术的发展，Vento-Tormo等 [8] 人在子宫中发现了三个具有不同免疫调节特征的dNK细胞亚群(dNK1, dNK2, dNK3)，并通过发现其细胞表达的组织常驻标记CD49a和CD9来支持这些发现。dNK1主要亚群为2型辅助性T细胞(TH2)，能够通过分泌生长促进因子来维持妊娠，并且可以表达调控CD39外的atp酶，该酶可以使促炎环境转变为免疫抑制环境。1型辅助性T细胞(TH1)主要为dNK2和dNK3细胞的亚群，主要分泌炎性细胞因子，对怀孕不利。而最新于小鼠的单细胞测序中发现一组新的uNK细胞亚群，(CYP26A1⁺uNK)，有利于妊娠的建立和维持 [11] [12] 。还有研究发现，dNK1细胞比dNK2与dNK3细胞含有更多的细胞质颗粒。例如穿孔素、颗粒溶素(GNLY)、颗粒酶A以及颗粒酶B [13] 。有趣的是，多次妊娠的dNK细胞中出现了记忆性NK细胞，称之为PTdNKs细胞，主要表现为LILRB1⁺NKG2C^high的特征，与dNK1细胞相似 [14] 。这些记忆细胞的百分比在初次怀孕时很低，但在随后怀孕中迅速增加。PTdNKs细胞可以在NKG2C与HLA-E、LILRB1与HLA-G相结合时，在白介素15 (interleukin-15, IL-5)的诱导下通过分泌干扰素-γ (interon-γ, IFN-γ)和血管内皮生长因子-a (Vascular endothelial growth factor-a, VEGF-a)来支持血管化，比初次怀孕女性表现出更早的EVT侵袭功能 [15] 。综上表明，dNK细胞有三个特异性亚群，根据其亚群不同被认为具有不同功能。dNK1在多胎妊娠中可以识别胚胎和具有记忆功能。dNK细胞的三种亚型也在免疫的调节和胎盘发育中与另外的细胞相互作用。

5. uNK在妊娠不同分化阶段的功能及影响分化的因素

5.1. 不同分化阶段的功能

虽然uNK细胞被认为属于NK细胞系，并含有大的细胞质颗粒，但是从小鼠怀孕子宫中分离出来时几乎没有杀死原NK细胞敏感靶细胞的细胞毒力，这与原有NK细胞能杀死病原微生物相矛盾。因此，怀疑可能存在一种短暂分泌期dNK (s-dNK)表型，在着床前后具有独特血管发育特征。分泌期dNK细胞刺激螺旋动脉的生长和发育，来确保子宫内膜有充分的血管以供着床。但妊娠早期，dNK细胞对血管细胞具有破坏稳定和促凋亡的作用以实现重塑螺旋动脉的过程，也是对发育中胎儿增加血供所必需的 [16] 。也有研究证实，uNK细胞在着床期和怀孕早期起着重要的作用。在着床期，子宫在卵巢激素的作用下“启动”释放促炎激素、细胞因子、趋化因子，包括IL-6、IL-15、IL-8、CXCL10、CXCL11，这些因子在着床时激活并招募大量的蜕膜免疫细胞到子宫内膜，其中65%~70%是uNK细胞。所以，uNK细胞在成功着床和为受孕建立血液供应中扮演重要角色 [17] 。uNK细胞在胎盘形成及胎儿发育阶段也发挥重要作用，着床和蜕膜之后胎盘快速生长和胎儿快速发育。有研究发现，胎盘形成之前，CD49a⁺亚群被鉴定出，并通过分泌生长因子促进胎儿发育，而缺少这些因子时后代骨骼发育异常，生长也会受限 [18] 。同样，Zhou等 [19] 人证明dNK细胞受转录因子PBXhomebox1 (PBX1)影响可以直接调节促生长因子的转录表达，并驱动胎儿生长。综上表明，uNK不是一个静止的细胞群，无论是分泌期促进血管的生长还是妊娠早期对血管的破坏，以及在胎盘形成和胎儿发育中都发挥重要作用，有利于怀孕的进行，而uNK的异常激活与不良妊娠结局有关。

5.2. 影响分化的因素

IL-15在分化中起到重要的作用，在分泌中期，子宫内膜开始表达高水平的IL-15。随着蜕膜化的进展IL-15被孕酮上调，由于uNK细胞上缺乏孕酮受体，孕激素可以间接刺激子宫内膜基质细胞分泌IL-15促进uNK细胞的增殖分化 [17] 。有研究通过小鼠模型证实，在胚胎着床前就存在IL-15的诱导，并在妊娠中期到达峰值。胚胎着床后，为了有利于uNK细胞的分化，蜕膜基质细胞(DSCs)和巨噬细胞也会分泌更多的IL-15。还有研究发现，蜕膜中转化生长因子β1 (Transform growth factor-β1, TGF-β1)的升高也可以导致uNK细胞亚群数量增加，并在调节免疫中发挥重要作用。综上表明uNK细胞分化受多种因素调控，IL-15和TGF-β1的影响至关重要 [20] 。

6. uNK细胞通过受体调节

抑制性和激活性受体

怀孕期间，uNK细胞表达的受体可以与EVT上的配体相互作用影响妊娠。dNK1细胞能够表达高水平的抑制和激活杀伤免疫球蛋白受体(KIRs) (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR2DS1, KIR2DS4)以及LILRB1。KIR的命名是根据细胞外免疫球蛋白样结构域(2D或3D)的数量和细胞质结构域的长度(长为L，短为S)而来 [21] 。是一种膜受体，可以和EVTs上存在的人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen-C, HLA-C) (经典的MHC-1类抗原)结合。这也意味着受体对EVTs的识别性较高以及可以调节胎盘。LILRB1是LILRs家族的一员，也是HLA-G二聚体的高亲和力受体，它们之间相互作用可以促进uNK细胞的生长促进因子分泌(Growth promoting factor, GPF)，有研究表明dNK细胞是胎盘中LILRB1的来源之一。dNK1细胞与dNK2细胞能共同表达激活性受体NKG2C和NKG2E，以及抑制性受体NKG2A，而dNK3细胞不表达 [22] 。表达激活性KIRs受体的uNK细胞能够增强胎盘，并对生殖和产科疾病提供帮助。KIR基因型主要由A和B两种单倍型组成，KIR A单倍型主要由7个基因组成，主要表达抑制性受体KIR2DL1/3和潜在的激活受体KIR2DS4，尽管是激活受体，但由于KIR2DS4最常见的等位基因缺失，导致具有两个A单倍型个体没有激活受体。这也是KIR AA基因型女性在和HLA-C2基因型的EVT相互作用时容易发生子痫前期的原因。KIR B单倍型包含多个激活KIR。HLA-C分子是KIR的配体，可分为两类，分别为C1表位和C2表位。C1表位的HLA-C分子与抑制性受体KIR2DL2和KIR2DL3结合能够限制uNK细胞的细胞毒性。C2表位的HLA-C分子与KIR2DL1相互作用可增加妊娠障碍的风险，而KIR2DS1通过与HLA-C2的相互作用保护妊娠 [23] 。综上表明，uNK细胞的受体KIR及其配体MHC-1类分子具有高度多态性，特殊的相互作用会增加妊娠相关并发症的发生率。因此，加强对KIR-MHC-1相互作用的机制了解有助于疾病的治疗策略。

7. uNK细胞在正常妊娠中的作用

首先，妊娠期间入侵的滋养细胞本是半同种异体，NK细胞能靶向杀死异物。但由于在健康的怀孕中，uNK细胞在EVT周围募集，使母体uNK细胞与滋养层表达的父系遗传异体抗原HLA-C之间发生相互作用，并主动在母胎界面发生了免疫耐受，从而没有被免疫系统当作异物清除。其次，螺旋动脉的重塑对于胎儿能否正常发育至关重要，螺旋动脉本是由外层血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell, VSMC)和内层内皮细胞(Endothelial cell, ECs)组成，而重塑是移除VSMCs和用EVT取代ECs的过程 [10] 。该过程中EVT能够在怀孕早期侵入蜕膜后使螺旋小动脉转变为大直径、高流量、低阻力的血管，实现母体与胎儿之间的营养运输。因此，适当的滋养层入侵有利于重塑螺旋动脉，维持妊娠。最后，滋养层的入侵与螺旋动脉重塑也离不开细胞因子的作用，在成功的怀孕中uNK细胞分泌多种细胞因子，即IL-1β、IL-8、IL-4、TGF-β1以及多种血管生成因子，如VEGF-A、VEGF-C、血管生成素来促进EVT的侵袭。所以综上表明，uNK细胞在正常怀孕中具有参与母体免疫耐受、调节滋养层侵袭以及重塑螺旋动脉的作用 [24] [25] 。

8. uNK在病理性妊娠中的作用

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion, RSA)、子痫前期(preeclampsia, PE)以及胎儿生长受限(fetal growth restriction, FGR)都属于大产科综合征(GOS)，EVT入侵缺陷导致的胎盘功能障碍是GOS最常见的发病机制。免疫细胞的紊乱也与其密切相关，而uNK细胞是子宫内膜中数量最多的免疫细胞，uNK细胞失衡可能是导致妊娠并发症的原因。

8.1. 子痫前期

PE是一种严重的妊娠并发症，其特点是妊娠20周后出现高血压，蛋白尿。最近发现，PE与uNK细胞关系最为密切，2%~7%的妊娠疾病由此引起，并与胎盘灌注缺陷和FGR相关。分娩是治疗该疾病唯一方法。有研究人员证实，在与健康孕妇相比时PE妇女的血清可溶性HLA-G (sHLA-G)水平显著降低，而正常情况下HLA-G可以在胎盘中广泛表达，因此低浓度的sHLA-G与PE增加有关 [26] 。在英国进行的一项研究发现PE患者于正常分娩女性相比，PE女性的KIRAA基因型频率会显著增加，而该基因的存在会使uNK细胞发生强烈的抑制，使胎儿拥有比母亲更多的HLA-C2基因，从而使动脉转化发生障碍，不利于胎盘形成进而导致疾病的发生 [27] 。也有报道称，PE患者毒性NK细胞数量增加，与uNK细胞相比PE患者穿孔素和颗粒酶B表达升高。因此，过度的细胞毒性导致孕早期滋养细胞层的凋亡并抑制了螺旋动脉的侵袭和迁移 [28] 。蜕膜TGF-β是蜕膜化的重要细胞因子，Zhang等 [29] 人发现PE患者TGF-β升高，并通过对IL-8、CD107a、IFN-g的表达水平下调使uNK细胞发生抑制引起胎盘功能受损诱发PE。综上表明，PE发病与uNK细胞受体、毒性细胞数量、细胞因子及细胞功能发生了改变有关。PE与FGR关系密切，高阻力的血管血流以及炎性的子宫微环境是PE引起的，而PE会导致FGR的发生。胎盘功能障碍引起的螺旋动脉重塑失败是FGR的主要原因。有研究通过对妊娠早期uNK细胞的一个子集的鉴定发现，这些细胞能够表达CD49a和Eomes，并可以产生生长促进因子(GPFs)，如骨桥蛋白、骨糖素、多营养素来促进胎儿的发育，而RSA患者GPF⁺uNK细胞缺乏，在小鼠中该细胞减少会导致FGR [30] 。

8.2. 复发性流产

RSA是指在妊娠20周之前与同一性伴侣发生连续两次或两次以上的妊娠失败。可能由多种因素导致，如染色体异常、遗传因素、解剖异常、免疫因素 [31] 。Giuliani等 [32] 人发现，RSA患者免疫系统异常活跃，uNK细胞在RSA中影响深远。位于蜕膜中的CD56^dimCD16⁺NK细胞明显高于非毒性CD56^brightCD16⁻NK细胞，而CD56^brightCD16⁻的表型与细胞因子的分泌相关，所以RSA的发生与uNK细胞较强的细胞毒性和缺乏足够数量的细胞因子来支持胎盘引起。有研究发现，与正常怀孕女性相比，RSA患者体外分离的uNK细胞能分泌更高水平的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)阻碍子宫内膜蜕膜化，而蜕膜化是成功妊娠的关键 [33] 。因此，蜕膜化功能障碍导致了RSA的发生。由于螺旋动脉重构与滋养层入侵在妊娠中扮演重要角色，而血管重塑过程是由uNK细胞产生的旁分泌系统调节的，所以血管生成与uNK细胞之间的关系会引起两种截然相反的妊娠障碍风险。一方面是动脉转化不足会导致血管生成因子产量低，滋养层入侵不足。另一方面是增加血管生成因子，会引起母胎界面过度氧化应激反应从而造成妊娠失败。综上所述，螺旋动脉转化不充分和滋养层侵袭不良与RSA有关，母体与胎儿界面只有严格的平衡发育才能够维持妊娠 [34] 。同样guo等 [35] 人也发现，RSA中高表达的miR-133a会使EVT中的HLA-G表达下调，导致uNK细胞分泌功能受损从而引起细胞促侵袭和促血管生成功能抑制。综上表明，uNK细胞在RSA中严重失调，RSA患者的细胞表型、细胞因子和受体可能是引起发病的主要机制，uNK细胞可能会作为靶向标志物用于治疗研究。但目前为止，没有可靠数据能够说明uNK细胞与RSA之间存在因果关系。

9. 总结与展望

uNK细胞在妊娠早期发挥关键的作用，和以往我们对NK细胞了解的不同，uNK细胞不仅没有对胚胎产生细胞毒性反应，反而在uNK细胞与EVTs上表达的HLA-C配体相互作用下参与了母胎耐受，保护了胎儿，并在滋养层入侵与血管重塑中起着重要作用 [36] 。对uNK细胞受体KIR与滋养层HLA-C相互作用的研究有利于我们预防妊娠并发症，如PE、RSA、FGR。母体KIR AA型基因与父系HLA-C2纯合子的结合不利于妊娠，所以加大对该方向的研究可以有效提高活产率 [37] 。PE大多数发生在妊娠晚期，但uNK细胞在妊娠早期血管重塑中发挥作用，而采集PE早期妊娠蜕膜样本很难实现，所以对于PE早期发病机制仍需进一步研究。