摘要: 目的：研究三叶青黄酮对荷肿瘤小鼠MDSCs、PGE2和COX-2的影响，以及它们在调控肿瘤免疫和逆转肿瘤免疫逃逸中的作用。方法：40只C57BL/6小鼠随机分为实验组、环磷酰胺组和三叶青黄酮高、中、低剂量组；每组8只小鼠(以下简称高，中，低)。结果：其它各组的肿瘤体积、肿瘤重量均明显低于模型组(P < 0.05)，外周血中COX-2和PGE2的水平以及脾脏中MDSCs的比例均明显低于模型组(P < 0.05)。小剂量组第8，12，14天的肿瘤体积明显大于环磷酰胺组(P < 0.05)，且外周血中COX-2和PGE2的浓度明显高于小剂量组(P < 0.0.05)，差异有统计学意义。中剂量组在第8天时，肿瘤变大，PGE2在外周血中的含量明显高于对照组(P < 0.05)；高剂量组第14天的瘤体明显缩小(P < 0.05)，与对照组比较差异有统计学意义。中低剂量组的肿瘤抑制率低于对照组(P < 0.05)，而MDSCs的比例高于对照组(P < 0.05)；结论：三叶青黄酮对肿瘤细胞有一定的抑制作用，这种抑制作用可能是通过抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡而实现的。
Abstract:
Objective: To study the effects of Trifolium flavone on MDSCs, PGE2 and COX-2 in tumor-bearing mice, and their role in regulating tumor immunity and reversing tumor immune escape. Methods: 40 C57BL/6 mice were randomly divided into experimental group, cyclophosphamide group and trifoliate flavonoid high-dose, medium-dose and low-dose groups. There were 8 mice in each group (hereinafter referred to as high, medium and low). Results: The tumor volume and tumor weight in other groups were significantly lower than those in model group (P < 0.05), the levels of COX-2 and PGE2 in peripheral blood and the proportion of MDSCs in spleen were significantly lower than those in model group (P < 0.05). The tumor volume in the low-dose group was significantly higher than that in the cyclophosphamide group at day 8, 12 and 14 (P < 0.05), and the concentrations of COX-2 and PGE2 in peripheral blood were significantly higher than those in the low-dose group (P < 0.05), with statistical significance. On the 8th day, the tumor was enlarged and the PGE2 content in pe-ripheral blood of the medium dose group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). The tumor volume of the high-dose group was significantly reduced on the 14th day (P < 0.05), and the difference was statistically significant compared with the control group. The tumor inhibition rate of medium-low dose group was lower than that of control group (P < 0.05), and the proportion of MDSCs was higher than that of control group (P < 0.05). Conclusion: Trifolium flavone has a certain inhibitory effect on tumor cells, which may be achieved by inhibiting the proliferation and apoptosis of tumor cells.
1. 引言
肿瘤免疫抑制是肿瘤发生、发展、转移及复发的重要原因，已成为当前肿瘤治疗领域亟待解决的难题 [1] 。髓源性抑制细胞(MDSCs)是近年来发现的一种新型免疫抑制细胞，可激活PGE2、COX-2和IL-6，增加Treg，抑制NK细胞和T细胞的免疫功能，并诱导M2型巨噬细胞产生 [2] [3] [4] 。三叶青具有显著的抗肿瘤活性，其中黄酮类化合物是三叶青抗肿瘤的重要物质基础 [5] [6] ，张祺箐、孙倩倩等 [7] [8] 早在2017就已经证实三叶青黄酮对肺癌小鼠体内PGE2、COX-2等免疫相关因子具有一定的调节作用，但其具体机制一直未阐明。本项目拟在前期工作基础上，利用荷Lewis肺癌模型，观察三叶总黄酮对荷肺癌小鼠脾脏内MDSCs比例的影响，验证三叶青黄酮对肺癌小鼠COX-2，PGE2等细胞因子的影响与MDSCs的关系，探索三叶总黄酮在体内的抗肿瘤效应及分子机制。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
浙江中医药大学动物试验中心(SCXY(沪)2003-0016)提供的SPF级5周龄C57BL/6雌性小鼠40只。饲养于浙江中医药大学实验动物中心，试验用的动物执照：SYXK(苏)2015-0001，动物伦理学批准编号：IACUC-20190729-13。在恒温25 ± 2度，恒湿60% ± 5%，SPF环境下自由摄食基础饲料1周。
2.2. 实验细胞
中国科学院上海细胞所购得的小鼠原代肺癌细胞系，浙江中医药大学动物试验中心冷冻保存。
2.3. 实验药物、试剂及仪器
三叶青是从浙江省中医医院购买的，浙江中医药大学药学系对其进行了初步的临床试验。三叶青总黄酮粉按照相应的方法进行萃取，三叶青总黄酮粉按照既定的方法溶解在蒸馏水中，按照需要配置100 mg/ml、50 mg/ml和25 mg/ml的高剂量、中剂量和低剂量。环磷酰胺胶囊是从齐鲁制药有限公司购买的，规格为0.5g，5支/盒，产品质量满足试验要求。达文生物科技公司生产的COX-2和PGE2 ELISA检测工具。Ly-6G (Gr-1), CD11b单抗(美国eBioscience，Inc.)上海精宏试验器材公司生产的DK-8D电加热恒温水箱。鼓风干燥器GZX-9140MBE (上海博迅工业有限公司)美国BIO-Rad酶联免疫检测装置(BIO-Rad) FACSCanto II型流式细胞术(美国BD公司)。
2.4. 动物分组及模型制备
以40只小鼠为研究对象，随机分为高、中两组；每组8只小鼠(以下简称高，中，低)。本项目拟采用浙江中医药大学动物试验中心的Lewis细胞进行体外回输，在保证细胞数量和质量的前提下，将细胞浓度调节到1 × 107个/mL，然后将0.2 mL的细胞悬浮液注入小鼠右腋下，建立荷带Lewis肺癌小鼠模型。
2.5. 给药方法
模型制备时间达24小时后，取高、中、低剂量组的三叶青黄酮0.2 mL，以100 mg/mL，50 mg/mL，25 mg/mL，每日给药。环磷酰胺组，以100 mg/ml/ml的浓度，每日口服0.2 ml。模型组以0.9%生理盐水灌胃，给小鼠喂服14天 [9] 。
2.6. 各指标检测方法
一般情况。在肿瘤疫苗接种之后，对试验动物进行常规监测，主要包括：试验动物的活动性、摄食、饮水状况，还有体重的增减情况，眼睛、被毛等异常情况。
ELISA检测小鼠血清中COX-2、PGE2含量 [10] [11] 。在灌胃14天后，从小鼠的眼球中取出血液，放入1.5 mL Ep试管，在室温下放置30~60分钟后，用3000× g离心10分钟，再用移液枪将血清提取出来，放入清洁的EP试管中，在−20℃下保存。按照标准的要求进行稀释。空白对照中仅加入显色剂A，B和终止液，不加入任何试样。将50微升的标准物质和50微升的链霉素–辣根过氧化物酶(HRP)分别放入标准物质孔中。将40微升的试样装入待测试样孔，接着分别装入10微升的抗COX-2抗体、50微升的链酶亲和素-HRP。用保鲜膜轻摇混合，37℃保温60分钟。仔细拆下封口板的薄膜，把里面的液体扔掉，然后抖落水份，在每个孔洞里注上水份；放置30秒，扔掉。重复五次。用手拍打干燥。首先将50微升的显色剂A注入到每个孔洞中，然后再将50微升的显色剂B注入到每个孔中，轻摇混合均匀后，在37℃的遮光条件下显色10分钟。加入50微升的终止溶液，在每个孔洞中(这时由蓝色从红色转变为黄色)结束反应。用无孔调零后，依次测定每个孔的吸收系数(OD)，并在45 nm处测定。检测必须在加入终止剂后10分钟之内完成。用COX-2法测定PGE2。以标准品的浓度和相应的OD值为基础，计算出标准曲线的直线回归方程，再以样品的OD值为基础，在回归方程上计算出相应的样品浓度。
取眼内血液后，将颈动脉脱位，将肿瘤完全切除，称量肿瘤重量，计算肿瘤抑制率。抑制肿瘤的比率 = (1 − 实验组肿瘤的平均重量/模型组肿瘤的平均重量) × 100%。
脾脏组织标本制备与检测。切断颈项，取脾脏，用玻璃片剂将脾脏粉碎，滤过筛子，获得细胞悬液。红血球溶解液避光溶解20分钟后，用PBS冲洗2次。PBS重悬细胞至1 × 106个/100μL，将100 μL放入流式管中，取1 mL PBS液洗涤细胞2次，取100 μL PBS液重悬细胞，按照细胞表面抗原染色法法标记表面抗原，在每管加入0.5 μL Anti-MouseLy-6 G (Gr-1) FITC，0.5 μL Anti-MouseCD11b PE，4℃避光培养30 min，然后上机进行检测。1.7统计方法应用SPSS Statistics19.0对试验数据进行处理，计量数据以x ± s为单位，进行单因子变异数分析，在方差齐性的情况下，使用LSD、SNK等方法进行多组间的配对比较，使用Dunnett’sT3方法进行比较。以P < 0.05为有显著性差异。
3. 结果
3.1. 各组小鼠瘤组织体积变化比较
所有组随着时间的增加肿瘤的体积都在不断的增大，而在同一时间内其他组与模型组相比，肿瘤体积则明显缩小(P < 0.05)。小剂量组第8、12、14天的肿瘤体积比环磷酰胺组大，差异有统计学意义(P < 0.05)。中剂量组第8天，瘤体增大，与对照组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。高剂量组第14天的瘤体明显缩小(P < 0.05)，与对照组比较差异有统计学意义(见表1)。
Table 1. Tumor volume in different groups of mice
表1. 不同组别小鼠肿瘤的体积
3.2. 各组小鼠瘤重及抑瘤率比较
14天后，其它各组肿瘤重量均低于模型组(P < 0.05)；小剂量组的肿瘤重量明显高于环磷酰胺组(P < 0.05)。中低剂量组和低剂量组的肿瘤抑制率均低于低剂量组(P < 0.05) (见表2)。
Table 2. Tumor weight and tumor inhibition rate of mice in different groups
表2. 不同组别小鼠肿瘤的重量、抑瘤率
3.3. 各组小鼠体内MDSCs比例以及COX-2、PGE2 含量比较
与模型组比较，各组MDSCs比例下降(P < 0.05)。与环磷酰胺组比较，低、中剂量组MDSCs比例较高(P < 0.05)。各组小鼠的外周血中COX-2和PGE2的水平均低于模型组(P < 0.05)，差异有统计学意义。与环磷酰胺组相比，低剂量组外周血液中COX-2和PGE2的水平显著升高(P < 0.05)，差异有统计学意义(见表3)。中剂量组外周血液中PGE 2水平显著高于对照组(P < 0.05)。
Table 3. Proportion of MDSCs and related protein levels in different groups of mice
表3. 不同组别小鼠体内MDSCs比例及相关蛋白水平
4. 讨论
早在1979年，Lord等正式提出了“肿瘤微环境(Tumor micro-environment, TME)”并得到了大家广泛认可，TME指肿瘤在发生、发展过程中所处的细胞微环境，它由肿瘤细胞本身、间质细胞以及少量浸润细胞和细胞生长所需的微血管、微淋巴管、组织液、众多细胞因子等共同构成 [12] 。肿瘤微环境中炎症因子、肿瘤细胞产生的细胞因子、肿瘤间质细胞分泌Toll样受体、补体等通过不同信号通路众多途径发挥负向免疫作用。我们前期实验发现，该模型组小鼠脾内MDSCs显著上调，外周血液中COX-2和PGE2显著上调，于是猜想MDSCs在肿瘤形成过程中可能扮演非常作用的角色，并且这种角色很可能与肿瘤免疫有关。本课题拟在前期研究基础上，以三叶青黄酮与环磷酰胺联合应用，观察其对小鼠肿瘤生长、小鼠肿瘤体积、小鼠脾内MDSCs比例、外周血液内COX-2、PGE2等的影响，并进一步验证其作用机制，为临床应用提供依据。结果表明，三叶青黄酮成分在高浓度下对MDSCs和PGE2、COX-2的抑制效果与环磷酰胺类似，但在高浓度下对MDSCs和PGE2、COX-2的抑制效果略好，这一现象可能与三叶青素类成分通过多个途径发挥抗肿瘤效应相关，值得深入探讨。
基金项目
本文系2018年湖南省衡阳市科技局指导性项目《三叶青黄酮对肺癌小鼠抗肿瘤作用的研究》，(课题编号：S2018F9031018293)阶段性研究成果之一；2020年，湖南省教育厅科学研究一般项目：《基于PAA/GO/M-NP电化学传感器检测黄酮类药物的研究》(项目编号：20C0688)的研究成果；2023湖南省教育规划“十四五”规划课题《高职药学专业“产学研用创”五位一体科教融汇人才培养模式的研究》(项目编号：ND233231)的研究成果；2021年，湖南省自然科学基金项目《基于金属硫化物MxSy负载贵金属纳米粒构建电化学传感器检测残留抗生素的研究》(项目编号：221JJ50088)的研究成果；2020年湖南环境生物职业技术学院校级青年基金项目《三叶青黄酮对肺癌小鼠抗肿瘤作用的研究》的阶段性研究成果。