1. 前言
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea (Hebert) Barr (无性世代：Pyricularia grisea (cooke) Sacc)引起的[1] 。是水稻的主要病害之一，对水稻生产危害极大 [2] 。在病害爆发年份里，一般可造成产量损失10%~50%，少数田块甚至绝收，同时严重影响稻米品质 [3] 。在水稻整个生育期内稻瘟病都可能发生，而现阶段控制稻瘟病最常用的两种途径分别是化学防治和培育新的抗稻瘟病品种。化学防治主要是通过使用农药控制稻瘟病发生，其一方面增加农业生产成本，同时对环境也会造成一定程度的污染。
实践证明，在众多防治措施中抗病品种的培育和种植是控制该病害最为经济、安全和有效的方法 [4] 。但由于稻瘟病菌小种的遗传复杂性及易变性，普通抗病品种往往种植3~5年后就易丧失抗性 [5] ，推广品种稻瘟病抗性周期短已成为水稻生产的主要障碍之一 [6] 。随着抗病资源的发掘，抗病基因的克隆及功能的进一步研究，已发现了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因 [10] ，并且越来越多的抗病基因通过分子标记选择技术及转基因技术被引入到栽培品种中，为抗稻瘟病育种的发展起到了及大的推动作用[24] -[34] [36] -[39] 。
2. 抗病资源发掘
种质资源是育种工作的物质基础。发掘抗谱广、抗性强而持久的抗稻瘟病资源是育种工作者的研究热点。迄今为止，国际上已鉴定出大量的广谱抗源，并已对部分抗源进行了抗稻瘟病基因的定位，如国际公认的非洲持久抗瘟品种Moroberekan，其对30个具有中国代表性稻瘟病菌株中的29个均表现出高抗，在西非地区种植多年仍表现为高抗。目前，认为Moroberekan含有3个主效抗瘟基因与10个QTLs。此外，Tetep、LAC23和Pai-Kan-Tao (PKT)等都是非常优良的广谱抗瘟品种，其中Tetep已在国际水稻研究所的育种计划中，广泛应用于高产、高抗稻瘟病水稻品种的培育，已有研究表明，Tetep中至少含有4个抗瘟基因、LAC23则至少含2个抗瘟基因、Pai-Kan-Tao (PKT)至少含有3个抗瘟基因。国内沈瑛等 [7] 利用具有广谱毒性的稻瘟病菌株，对我国很多杂交稻以及籼、粳品种进行了抗病性的鉴定、筛选，选出了春江25、春江68、品969和源珍116等4个品系具有广谱的抗瘟性，能抗所有的参试菌株，但其抗性基因尚不明确。此外，谷梅2号和地谷对多个稻瘟病菌系均表现出高度抗性，是我国抗性育种中的重要抗源材料。谷梅2号第6染色体上定位有Pi-25、Pi-26两个抗性基因 [8] ，地谷第2染色体上定位有Pi-d(t)1和Pi-d2 [9] 。上述研究表明，持久抗性品种的抗瘟性由垂直抗性和水平抗性组成，广谱的质量抗性和高水平的数量抗性相结合，保证了它们持久而稳定的稻瘟病抗性。
3. 抗稻瘟病基因研究
20世纪60年代中期，日本率先开展了水稻品种抗稻瘟病基因分析的研究工作，鉴定了最初的8个抗性位点上的14个基因，并建立了一套抗稻瘟病基因分析用的鉴别体系(JDCs，Japanse differential cultivars)，随后，国际水稻研究所和中国等产稻国也逐渐开展了水稻稻瘟病抗性遗传的系统性研究。截至2013年8月，已至少报道了68个抗稻瘟病位点共83个主效基因。这些基因成簇地分布于除第3染色体外的所有水稻染色体上(2个隐性，其它显性)，其中，Pb1, Pia, Pib, Pid2, Pid3, Pik, Pik-h/Pi54, Pik-m, Pik-p, Pish, Pit, Pita, Piz-t, Pi1, Pi2, Pi5, Pi9, pi21, Pi25, Pi36, Pi37, Pi56, PiCO39等23个基因已被成功克隆(Pi2、Pi9、Piz-t同为Piz位点上的复等位基因；Pi1、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p同为Pik位点上的复等位基因；Pid3与Pi25等位；Pia与PiCO39等位) [10] 。
据研究表明，绝大多数抗稻瘟病基因都属于NBS-LRR家族基因，水稻NBS-LRR蛋白质在防御稻瘟病菌侵染时，激活下游级联反应并构成调控网络，在水稻天然免疫反应中起关键性的作用。NBS-LR蛋白质含有2个特殊的结构域：核苷酸结合位点(NBS)及富亮氨酸重复序列(LRR)。NBS含有3个高度保守的关键基序：激酶1a (或磷酸结合环P-loop)、激酶2a和激酶3a。该结构域具有ATP或GTP结合水解功能，通过获得能量来抵御病原菌入侵并能够改ATP的构象从而传递信号分子 [11] 。
NBS-LRR类抗病基因在染色体区段常成簇分布，稻瘟病抗性基因多集中出现在第2、6、8、11、12等染色体上。水稻主效抗稻瘟病基因中除Pi-21和Pi-d2外，其余基因都编码氨基端含有CC结构域的NBS-LRR类蛋白质。Pi-21的产物富含脯氨酸及重金属和蛋白质相互作用结构域，它介导水稻产生一种持久且慢速的抗病反应 [12] 。Pi-d2编码跨膜受体激酶(Receptor like kinase，RLK)，氨基端含有特殊的膜外凝集素(B-lectin)结构，羧基端为丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(Ser/Thr kinase，STK) [13] 。Pi-k是现阶段被发现并克隆的等位基因最多的抗性位点，该位点主要包括Pi-1、Pi-7、Pik-m、Pik-p、Pik-s、Pik-h /Pi54 [14] 。Das等 [15] 从野生稻中克隆了与Pi-54同源并携带特殊C3H锌指蛋白质结构的Pi54rh基因，该基因对印度多个稻瘟病菌生理小种表现为高抗。Pi-ta是最早发现的能与效应蛋白质AVR-Pita直接识别的抗病基因；Jia等 [16] 鉴定了与之共分离的Ptr(t)基因，发现Ptr(t)基因对含有AVR-Pita基因的生理小种同样具有抗性，这表明NBS-LRR蛋白质之间可能通过相互作用形成特殊的复合体以应对稻瘟病菌侵染。Piz-t位点也含有多个复等位基因包括：Pi-2、Pi-9、Pi-z、Pi50及Pi-gm。Piz-t编码1个NBS和3个LRR，与Pi-z在LRR区有8个氨基酸的差异，该变异决定了植株的特异性抗性 [17] 。Pi-a与Pi-k基因相似，由2个相邻的基因构成 [18] 。Pi-b的表达易受温度和光照等环境因素的诱导，其编码产物的NBS区含有3个保守结构，17个LRR区有8个成簇分布的半胱氨酸残基 [19] 。Pi-d3和Pi-25等位，其产物含有NBS-LRR与MHD基序 [20] 。Pb1基因对穗瘟表现为高抗，Pb1蛋白质的某些结构出现了高度退化，如NBS区不包含高度保守的p-loop结构，而且Pb1蛋白质会随着水稻的不断生长而逐渐增加积累，这也是Pb1在水稻成熟时期对穗瘟表现为高抗的关键原因 [21] 。Pi-t上游存在Renovator的长末端重复(LTR)反转录转座子，该结构是Pi-t应对生理小种所必须的 [22] 。Pi-36与Pi-37均为氨基酸置换使植株获得抗性，Pi-36为单拷贝基因，与大麦抗白粉病基因Mla相似，Mla的CC结构可作为功能亚基与下游信号产生相互作用，Pi-36可能也存在类似功能 [23] 。
4. 分子标记选择育种
近年来，水稻稻瘟病抗病分子育种取得了一定的进展。Hittalmani等 [24] 利用紧密连锁进行Pi-z5基因的选择，纯合抗病F2植株的选择准确率达100%。李仕贵等 [25] 用与稻瘟病抗性基因Pi-d(t)紧密连锁的微卫星标记RM262，对含有该抗病基因的地方品种地谷与感病品种江南香糯、8987的F2群体进行分子标记辅助选择，发现应用该标记所选择纯合和杂合带型的抗性植株的准确率可达98%以上。刘士平等 [26] 利用位于第11染色体上的与Pi-1紧密连锁的SSR标记RZ536和RM144对保持系珍汕97进行改良，在BC3F1代进行筛选，得到17株含Pi-1的纯合株系。Hittalmani等 [27] 利用MAS技术将抗稻瘟病基因Pi-1、Pi-z5和Pi-ta聚合到同一个水稻品系BL124中。王忠华等 [28] 应用与Pi-ta连锁的共显性标记对350个杂交F3代株系进行早期筛选，得到118个含Pi-ta的抗病纯合株系。陈学伟等 [29] 分别将地谷、BL-1和Pi-4号3个水稻品种中的Pi-d(t)、Pi-b和Pi-ta抗性基因聚合到保持系杂交品种G46B中，其稻瘟病抗性得到明显提高。金素娟等 [30] 将Pi-1基因导入GD-8S中。杨杰等 [31] 利用Pita和Pib基因的功能标记，检测和分析了我国115份水稻地方品种的Pita和Pib基因型。靳春鹏等 [32] 利用与6个抗病基因连锁的分子标记检测了吉林省水稻品种中抗性基因的分布情况。王金明等 [33] 利用分子标记获得Pi40和Pib的聚合材料。与传统抗病育种相结合，这些利用分子标记辅助选择技术育成的改良株系的稻瘟病抗性均有明显的提高。孙大元等 [34] 通过回交及自交，并结合分子标记辅助选择，将广谱抗源H4的一个主效抗稻瘟病基因Pi46导入到优良恢复系航恢173中，并在BC2F4群体中选育到一个株叶形态较好的株系，暂命名为航恢1173。分析结果表明，航恢1173比航恢173的抗谱得以明显拓宽，并无显著的农艺性状差异，且所配杂交组合的抗性也得到显著的提高。田大刚等 [35] 利用杂交水稻恢复系闽恢3189、闽恢3229和闽恢6118为受体亲本，以携带抗稻瘟病主基因Pi9的C750和抗白叶枯病主基因Xa23的C682为供体亲本，利用分子标记辅助选择和田间鉴定选择相结合方法，经过多代回交、自交，获得8个导入Pi9或Xa23或Pi9 + Xa23的水稻恢复系分子改良系。以19个福建近年稻瘟菌优势菌株和一个白叶枯病强致病菌株P6进行人工接种，结果表明，Pi9或Xa23的导入明显提高了水稻恢复系分子改良系的稻瘟病或白叶枯病抗性。分子改良系及其杂交组合的有效穗数、千粒重和单株产量等与受体亲本及其杂交组合的相关农艺性状无明显差异。通过对抗稻瘟病基因的定位、克隆及分子标记的开发与利用，大大加快了抗病基因的聚合，在生产中育成了一大批稻瘟病抗优良品种，有效的提高了水稻产量。
5. 转基因技术育种
通过转基因手段导入R基因，可以克服常规和MAS育种中连锁累赘障碍，是改良水稻品种抗病性的最有效措施之一。S. Qu等 [36] 将自身启动子驱动的Pi9基因转入感病品种TP309，在其T2选育出转基因纯合株系，且保持了Pi9原有的广谱高抗特性。另外，通过转基因手段可以打破等位基因的局限，聚合同一Pi9/2位点的广谱抗性基因Pi9、Pi2、Piz-t等 [37] 或Pk位点的R基因Pi1、Pik、Pikp、Pikm等 [38] 。通过转基因实施R基因的聚合，最好是选择那些不需要借助配体蛋白(partner protein)即可识别无毒基因产物的R基因，以期快速、高效地培育广谱抗病新品种。近年来，伴随我国转基因生物新品种培育重大专项的实施，一些重要的R基因，如Pi9、Pi2、Piz-t、Pigm、Pid2、Pid3、Pi1、Pik-p等已开始应用于转基因抗稻瘟病育种 [39] 。
6. 结语
中国水稻品种资源十分丰富，蕴藏着各种性状的遗传基因。分子生物学的发展极大地推进了稻瘟病抗性遗传研究的进程，使进一步发掘、克隆、利用抗稻瘟病基因，拓宽品种抗性成为可能，并且通过育种家的努力，育成了很多抗稻瘟病性优良的品种，然而在利用抗稻瘟病基因的同时，同样应该加强稻瘟病菌生理小种变化的研究，通过对不同生理小种致病性变化的研究，合理的对含有不同抗病基因的品种进行轮换与布局，使抗病品种不会对稻瘟病菌生理小种产生过大选择压力，造成生理小种的变化过快，使抗病品种短期丧失抗性。